Genetik Vollmodul Flashcards
Was ist horizontaler Gentransfer?
Übertragung von genetischem Material von einem Organismus in einen bereits existierenden hinein
Was ist ein Alignment? Was ist BLAST?
Alignment: Vergleich zweier oder mehrerer Strings (Sequenzen)
BLAST: basic local alignment seach tool → algorithmus zum algnmentvergleich
Woraus besteht das menschliche Genom gehäuft?
Repetitive Sequenzen:
- Derivate von Transposons (LINE, SINE)
- Pseudogene
- einfache Sequenzrepeats (Mini-,Mikrosatellit)
- 1,5% Gene (proteinkodierende Region)
Was wird beim Menschen in der Zelle maternal vererbt, was paternal?
Maternal wird die mitochondriale DNA vererbt
Paternal wird das Y-Chromosom vererbt
Was ist die Funktion von Telomeren?
- Schutzkappe am Ende der Chromosomen
- helfen bei der Lokalisierung der Chromosomen im Zellkern
Was ist die Hay-Flick-Grenze?
Die hay flick Grenze beschreibt die kritische Länge der Telomere, ab denen sie nicht mehr lebensfähig sind und die Apoptose eingeleitet wird
Woraus besteht die Telomerase?
- RNA-Bestandteile, template strang
- Protein: reverse Transkriptase, Dyskerin (Est1,2,3 →ever shorter telomer)
Regulation der Telomeraseaktivität
Cdc13: ssDNA-bindend
- Präferenz für G-reiche Sequenzen
- bindet an 3’Überhang → rekrutiert Est 1,2,3 → Telomerase (TLC1) aktiv → verlängert Strang+
- Inhibition: Protein Stn1 wird rekrutiert → negativer Regulator → inhibiert TLC1 (Cdc13-Telomerase)
Telomerlängen-Homöostase
- Rap1 erkennt Repeats und bindet an dsDNA
- Rif1 bindet an Rap1 → inhibiert Telomerase
- je länger Telomer, umso mehr Rap1 und Rif1 und umso mehr wird Telomerase inhibiert
→ bei DNA-Replikation: Telomere werden kürzer → weniger Rap1 und Rif1 → Telomerase inhibiert → Zyklus
Woraus besteht das Zentromer?
- repetitive Sequenzen
- aus konstitutivem Heterochromatin, perizentrisch (beide Arme des Chromosoms betreffend)
- Chromatin am Zentromer: Mischung aus CENP-A und H3
Was ist das Kinetochor?
Verbindung von Chromatin und Mikrotubuli am Zentromer während der G1-Phase
Wie ist das Kinetochor aufgebaut?
innere Platte (direkt mit dem Nukleosomen assoziiert): CENP - H - assoziierte Proteine
- äußere Platte: KMN-Netzwerk
- Linker (vermitteln zwichen den Platten) CCAN: CENP-T, W, S, X, Ctf19 Komplex
Dam1 Ring wird an Mikrotubulidurch mechanische Kraft zurückgezogen → zieht ganzes Tochterchromosom mit
Was ist EDTA?
Ethylendiamintetraessigsäure:
Komplexbildner für die Mg2+ und Mn2+ Kofaktoren der DNAsen
Was macht Ethidiumbromid?
Interkaliert mit der DNA
Wie funktioniert die DNA-Gelelektrophorese?
Für die Bestimmung der Existenz gewünschter DNA-Fragmente
- Agarose-Konzentration bestimmt die Maschenweite
- abnehmende Größe der DNA-Fragmente: je kleiner die Fragmente, desto weiter diffundieren sie im Gel
Wie kann man DNA markieren?
- radioaktive Isotope
- Nukleotide, die modifiziert sind und über Antikörper erkannt werden
- Nukleotide, deren Basen mit Makromolekülen gekoppelt sind und auch über Antikörper erkannt werden
- Nukleotide, die über eine Komplexbildung mit anderen Makromolekülen den Nachweis erlauben
Was braucht man für die PCR?
- denaturierte DNA
- dNTP
- Polymerase (hitzebeständig→Taq-Pol)
- Puffer
- Primer
Was ist Nick-Translation?
DNAse I entfernt einen Strang an zufälligen kleinen Abschnitte
→ Pol I bindet markierte Nukleotide an den Abschnitten
Was ist randompriming?
DNA wird denaturiert, dann binden Primer
→ Pol I bindet markierte Nukleotide an kompletten Komplementärstrang
Was ist cDNA und wofür wird es benutzt?
complementary DNA
Da RNA sensitiv für RNAsen ist (brauchen keinen Kofaktor) wird mRNA in cDNA umgeschrieben mit reverser Transkriptase
Was ist ein Vektor? Welche Eigenschaften müssen sie haben?
Ein Vektor ist ein Transportvehikel, welches ausgewählte DNA aufnehmen kann.
Können FremdDNA aufnehmen
Können sich in Wirtszellen autonom vermehren
oft Plasmide oder Bakteriophagen
sollte auch ein Resistenzgen enthalten (zur Überprüfungen ob es klappt)
Was sind Restriktionsenzyme?
Restriktionsenzyme (=Restriktionsendonucleasen)
Bakterielle Proteine, dei DNA -Stränge an Phosphatdieesterbindungen spalten
Was für Klassen von Restriktionsenzyme gibt es?
- Klasse: Erkennungssequenz 15bp, schneiden ca. 1000bp in 3’Richtung
- Klasse: schneiden innerhalt der Erkennungssequenz
- Erkennungssequenz ist palindromisch
- Lage der pal. Seq. oft 4,6 bzw. 8 Basen
- Statistisch wird es alle 4⁴,4⁶ oder 4⁸ Bp geschnitten
- einige Enzyme generieren 5’ oder 3’ Überhänge
andere generieren keine Überhänge - Klasse: Schneiden in definiertem Abstand
Was sind sticky ends?
Wenn beim Schneiden der DNA 3’-oder 5’ Überhänge entstehen, nennt man diese “sticky ends”
Was sind blunt ends?
Wenn beim Schneiden der DNA keine ssDNA-Überhänge existieren, dann nennt man das Ende blunt end
Was enthält ein Plasmid?
- Replikationsursprung (origin)
- Resistenzgen gegen Antibiotika
- multiple Cloning site (polylinker)
Was ist ein GVO (gentechnisch veränderter Organismus)
Ein Organismus, der DNA-Sequenzen eines anderen Organismus enthält und nicht durch Kreuzung hergestellt wurde
Was ist Rekombinante DNA?
neues DNA-Molekül, das durch Kombination von zwei nicht-homologen Fragmenten entstanden ist
Was ist das GenTG?
Das Gentechnikgesetz (1990), welches der rechtliche Rahmen für Forschung, Entwicklung und Nutzung der Gentechnik ist.
Wie funktioniert die DNA-Klonierung?
Ziel: einführen eines DNA-Abschnittes in ein geeigneten Vektor in einem Wirt → Expression der DNA
- gew. DNA wird in den Wirt gebracht
- Plasmid wird mit Restr.Enzymen geschnitten
→ gew. DNA ligiert in die Plasmiden-DNA und wird somit in die Plasmiden-DNA aufgenommen
Was ist der Unterschied zwischen gerichteter und ungerichteter Klonierung?
gerichtete Klonierung: Vektor und Insert werden mit ZWEI unterschiedlichen Restriktionsenzymen behandelt
→ Gen wird in gewünschter Richtung ins Plasmid ligiert
ungerichtete Klonierung: Vektor und Insert werden mit EINEM Restriktionsenzym behandelt
→ beide Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors kompatibel
Selbstligation (Vektor)
Vektor ligiert sich selber und Fremd-DNA wird nicht aufgenommen
- kann durch Phosphatase verhindert werden, welche die Phosphatgruppen der 5’-Enden des Vektors schneiden
Was bedeutet die Hybridisierung?
Ausbildung doppelsträngiger Nukleinsäuren (dsDNA oder dsRNA) aus einzelsträngigen Nukleinsäuren
Welche Varianten der genetischen Analyse gibt es?
forwards genetics
reverse genetics
Was ist das Ziel der genetischen Analyse?
Man möchte damit herausfinden welche Funktion ein Protein hat
Wie funktioniert forward genetics?
man überlegt vorher welchen Phänotypmutanten man haben will
man nimmt Wildtypphänotypen → mutiert diese zufällig → filtert gewünschten mutierten Phänotyp heraus → untersucht Gen
→ weiß wie Protein aussieht
Mutagene
UV-Strahlung, Methymethan-Sulfonat (MMS), Ethyl-Methylsulfonat (EMS)
Mutagenese
Organismen werden mutiert
- nicht zielgerichtet
- Population von mutierten Organismen
Unterschied zwischen genetische Selektion und gen. Screening
genetische Selektion nur gewünschte überleben
genetisches Screening: alle überleben, man muss sich richtiges einzeln raussuchen
Komplementation
funktionelle Ergänzung zweier mutierter Allele
verschiedene Mutanten → muss gucken, ob gleiche oder untersch. Mutation besitzen bzw. ob sie in Verbindung miteinander stehen
wenn sie sich ergänzen müsste die Kreuzung aus 2 verschiedenen Mutanten den Wildtyp ergeben.
Was sind reverse genetics?
Prozess andersrum als forward genetics.
vordergründige Frage: Welcher Phänotyp entsteht wenn ich ein bestimmtes Gen mutiere?
bioch. Prozess → Protein → Gen (Mutation)→ Phänotypanalyse
Welche Methoden gibt es, um nur ein Gen zu isolieren?
Gen-Knock-Out: Gen wird durch homologes Marker-Gen am linearen DNA-Molekül durch homologe Rekombination ausgetauscht (nicht kodierend)
gezielte Mutation: Unterbrechung der Genfunktion
genome editing
RNA Interferenz (entsprechende mRNA wird abgebaut )
chemical genetics: Reduktion der Aktivität eines Proteins durch einen chemischen Inhibitor
Welche eukaryotischen Modellorganismen gibt es?
Hefe: Saccharomyces cerevisae
Pflanzen: Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand)
Tiere:
- Caenorhabditis elegans (Nematode)
- Drosophila melanogaster
- Danio rerio (Zebrafisch)
- Mus musculus (Maus)
- Rattus norvegicus (Ratte)
Was ist der Southern Blot?
Nachweis eines DNA-Fragments in einem DNA Gemisch
- Restriktionsverdauung von DNA
- Auftragen auf Gel
- Transferierung der DNA des Gels auf auf feste Unterlage (zb Nylonmembran) Transfer: trockene Papiertücher ziehen Wasser zusammen mit Gene auf Membran
- Hybridisierung: komplementäre Sonde zum gesuchten Gen (ssDNA, Einzelstrang durch Erhitzen)
→gibt Sonde in Lösung auf Membran
→ Hybridisierung mit komplementrären Strängen in Gel
→ markierte Stellen auf Membran (Sonde markiert zb. radioaktiv, Fluoreszenz) - Autoradiogramm: Schwärzen an Stellen mit Sonde
Northern Blot
Nachweis eines RNA-Fragments in einem RNA-Gemisch
markierte Sonde ist auch DNA
Westernblot
Nachweis eines Proteins in einem Proteingemisch mittels eines Antikörpers:
- Proteine auf Gel auftragen → Transfer auf Membran
- Inkubation mit primären Antikörper (bindet an Zielprotein)
- Inkubation mit sekundären Antikörper (bindet an primären Antikörper und ist an ein Enzym gekoppelt, welches bei Bindung eine Reaktion katalysiert)
Was ist die Sanger-Sequenzierung?
Kettenabbruch-Methode:
- man gibt Nukleotide dazu, die kein 3’OH-Ende haben → Kettenabbruch → Gemisch von verschieden langen abgebrochenen Fragmenten
Beispiel: nur Adenin-Nukleotide → Kette hört auf, wo Adenin ist → kann Position im Agarosegel ablesen
Wenn dies mit allen Basen gemacht wird → komplette Sequenzierung
Was ist die Illumina-Sequenzierung?
- bindet definierte Linker-Sequenz an DNA-Probe
- Probe wird auf Cluster gegeben
- Linker binden an Cluster-linker
Wie funktioniert die Massenspektrometrie?
Identifizierung eines Peptids anhand der Masse
Fragmentierung des Proteins (Trypsin)
MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization)
Was ist SILAC? Wie funktioniert es?
SILAC= stable isotope labeling with amino acids in cell culture
Erweiterung der MS
¹³C-markiertes Arginin → alle AS der Protein der 1. Probe sind mit schweren Isotopen markiert
2. Probe ist normal, eine wird gestresst, andere nicht
zusammenbringen und SDS-PAGE
Peptidfragmentierung mit Trypsin
Vergleich der Verhältnisse Protein 1 : Protein 2
→ charakteristische Differenz → markierte Peptide können identifiziert werden
Quantitative Analyse der Mengenänderung zweier Proteine zueinander
Was bedeutet SDS-PAGE?
SDS = Natriumdodecylsulfat PAGE = PolyAcryl Gel Electrophoresis
Was sind Arten der funktionellen Genomik?
Enhancer trap
Gal4/UAS-System
Wie funktioniert die enhancer trap?
p - Element (Transposon) mit lacZ Gen in der Nähe der IR (inverted repeats)
Transposition: lässt Element im Genom rumspringen → springt zufällig in Nähe eines Enhancers (inseriert)
→ Enhancer aktiviert lacZ → lacZ-Expression
vllt Gen-KO des eigentlichen Gens, macht viele Transpositionsereignisse
→ Sammlung dieser Ereignisse → lacZ Färbung → verschiedene Muster → Gen kann besser verstanden werden
Wie funktioniert das Gal4/UAS-System?
Gal4: Transkriptionsaktivator aus Hefe, funktioniert universell
bindet spezifisch an UAS (upstream activating sequence), wodurch ein downstream gelegenes Zielgen aktiviert wird
damit können beliebige klonierte Gene gezielt in bestimmten Zellen oder Geweben aktiviert werden
Welche Methoden enthält genome editing?
Punktmutationen: leichter Funktionsverlust → Funktionsanalye des Proteins
Doppelstrangbruchkorrektur:
- homologe Rekombination: homologes Gen wird eingebaut
- NHEJ (non-homologe end joining): nichthomologes Gen wird eingebaut
Doppelstrangbruch einbauen:
Crispr/cas9
Zink-Finger Endonukleasen
TALEN
Wie funktionieren Zink-Finger Endonukleasen?
Restriktionsendonuklease mit 2 Domänen:
- Domäne: Zinkfinger → erkennt Basentriplett
- Domäne: Endonuklease
Zinkfinger erkennen bestimmmte DNA-Sequenz (können designed werden)
→ binden DNA-Sequenz
→ Nuklease schneidet
→ dort bietet man homologes Stück zur Mutation an
→ wird eingebaut
Nachteile: Schwer zu designen, toxisch, spalten auch häufig woanders
Wofür benutzt man Crispr/Cas9?
Wird benutzt um gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einzubauen
CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Cas9: CRISPR-associated → Endonuklease
Welche Forschungen werden in der humanen Zytogenetik gemacht?
Karyogramm von Chromosomen in der Metaphase
Chromosomenbänderung
FISH (Fluoreszenz in situ hybridisierung)
Was wird in der Zwillingsforschung gemacht?
Analyse und Unterscheiden von Genotypen zu Phänotypen
Untersuchung von Gruppen monozygoter (eineiig) vs dizygoter (zweieiig) Zwillinge
→ bei genetisch bedingten Phänotypen sin indiesem Merkmal eineiige Zwillinge sich ähnlich
→ bei umweltbedingten Phänotypen unterscheiden sich eineiige Zwillinge ähnlich den zweieiigen Zwillingen
Was für Beispiele gibt es für autosomal-rezessive Krankheiten?
Albinismus
Phenylketourie
zystische Fibrose (Mukoviszidose)
Was für eine Art Krankheit ist die Sichelzellenanämie?
eine kodominante Erbkrankheit: Mutation der beta-Kette des Hämoglobins Personen mit HbA/HbA: Wildtyp Personen mit HbA/HbS: Sichelzellenanämie Personen mit HbS/HbS: schwere Anämie
Heterogenität hat einen evolutionären Vorteil:
Malaria weniger präsent bei Menschen mit Sichelzellenanämie
Welche Krankheiten sind x-Chromosomal?
Hämophilie
Duchennsche Muskeldystrophie
Farbenblindheit
Welche Krankheiten sind Autosomal-dominant?
Chorea-Huntington:
→repeat expansion im Huntington-Gen
→ Huntington-Aggregate (Proteine) lagern sich im Gehirn an und die Krankheit tritt erst später auf
Was ist eine Population?
Fortpflanzungsgemeinschaft innerhalb einer Art
Was ist eine Variation?
Unterschiede äußerlicher Merkmale (auch messbare Größen)
Was ist eine Mendelpopulation?
- Organismen sind diploid
- Es müssen Gameten gebildet werden → sexuelle Fortpflanzung
- Panmixie: Zufallswahl eines Partners bei der Fortpflanzung
- Population muss ausreichend groß sein
- können sowohl auto- als auch gonosomal sein
Welche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Äquilibrium kann es geben?
- Population keine Mendelpopulation
- Inzest: Führt zu einer erhöhten Rate von Homozygotie
- geringe Populationsgröße: random drift (ein Allel kommt erhäuft vor)
- Selektion
Was bedeutet Alterung?
Abnahme der Überlebenswahrscheinlichkeit, Progressiver Verlust der Produktion, Fertilitätsabnahme, Mortalitätszunahme
Was bedeutet Mortiliät?
Sterberate, Wahrscheinlichkeit zu sterben
Was wird bei der Altersforschung untersucht?
- Suche nach unter oder überrepräsentierten Allelvarianten bei sehr alten Menschen
Welche Genvarianten sind verknüpft mit langem Leben?
Allel des APOB-Gens (Cholesterin): → kürzeres Lebensalter
- Allel von FOXO3A (Insulinsignalweg) → Langlebigkeit
- Homozygosität → Langlebigkeit
- reaktive Sauerstoffspezies mit Alterung assoziiert
- TOR- und Insulinsignalweg: Inhibierung →Lebensverlängerung
- Telomerase → Ziel für Anti-Krebs-Mittel
- Organismus mit längeren Telomeren/ Telomere langsamer abbaut lebt länger (stimmt aber nur manchmal → Mäuse haben längere Telomere und sterben früher)
Welche zwei Arten von Alterung gibt es?
chronologische Alterung: (Zellen in stationärer Phase sollen zurück in Zellzyklus → wie lang dauert das?) man bringt Zelle aus G0-Phase wieder zum Teilen → postmitotische Zellen werden untersucht
replikative Alterung (wie häufig kann sich Zelle teilen): mitotische Zellen werden untersucht
Welche Arten von Geschlechtsbestimmungen gibt es? Wo tritt welche auf?
- Y-Chromosomale Geschlechtsbestimmung: bei Säugetieren
- Verhältnis von X-Chromosom zu Autosomen: bei Drosophila, C. elegans
Wie funktioniert die Geschlechtsbestimmung bei Säugetieren?
SRY (sex-determining region of y-gene) ist das bestimmende Gen für das männliche Geschlecht
→ kodiert den Transkriptionsfactor TDF (testis-determining factor) welcher mit der HMG-Domäne (high mobility group) andere Transkriptionsfaktoren und Gene reguliert, die die Ausprägung der Hoden zur Folge hat
In den Hoden wird dann Testosteron gebildet, welches die weitere ausbildung geschlechtsspezifischer Merkmale zur Folge hat → hormonelle Steuerung
Wie wird das Geschlecht bei Drosophila bestimmt?
Das Verhältnis von x-Chromosomen zu Autosomen ist geschlechtsbestimmend: → X/A = 1 → weiblich → X/A = 0,5 → männlich X-Gene: Numeratorgene A-Gene: Denominatorgene
Was für Numeratorgene gibt es bei Drosophila? Wo sind diese lokalisiert?
sis A, B, C
Auf dem X-Chromoso
Was für Denominatorgene gibt es bei Drosophila? wo sind diese lokalisiert?
deadpan (dpn)
Liegt auf den Autosomen
Welches ist das Schlüsselgen für die Geschlechtsbestimung bei Drosophila?
sxl: sex-lethal
RNA-bindenes Protein, reguliert alternatives Spleißen der mRNA
sxl hoch: weiblich
sxl niedrig: männlich
Was ist die Funktion von sxl?
Regulierung von tra und dsx über Regulation von Spleißing
Tra: reguliert Spleißen von dsx
→dsx F: weiblich oder dsx M: männlich
diese Regulation ist zellautonom
Was sind die Numeratorgene/Denominatorgen von C.elegans?
Numeratorgene:
Sex-1 (Kernrezeptor, Hormonrezeptor)
Fox-1 RNA bindendes Protein
Denominatorgene: Sea-1, Txn (Aktivator für xol-1)
Wie wird das Geschlecht bei C.elegans bestimmt?
Verhältnis von X-Chromosomen zu Autosomen ist relevant X/A:
Bis 0,67: männlich
Ab 0,75: hermaphrodit
Was ist das Schlüsselgen zur Geschlechtsbestimmung bei C-elegans? Wofür ist es zuständig?
xol-1 (X0-lethal)
xol-1 hoch: männlich
xol-1 niedrig: hermaphrodit
xol-1 ist ein Sdc-2 Repressor
Wofür ist Sdc-2 verantwortlich?
Ist ein Gen für Dosiskompensationskomplex
→ reprimiert x-Gene
Was ist her 1?
her-1: Ein Gen, welches wenn abgeschaltet zur Hermaphrodisierung bei C. elegans führt
wird durch Sdc-2 reprimiert
reprimiert tra-1
Was ist tra-1?
Zink-Fingerprotein, TF für eine ganze Reihe von Proteinen
wird von her-1 reprimiert
Welche Mechanismen gehören zur Grundlage der Epigenetik?
- Posttranslationale Modifikation von Histonen
- Nukleosompositionen (Histone sind grundsätzlich repressiv für die Expression)
- Homologe Histone: Histonvarianten
- Modifikation von DNA (DNA-Methylierung)
- nicht kodierende RNA (microRNA, piRNA, strukturelle RNA(lncRNA))
Was ist die Epigenetik?
Die Summe der Veränderungen im Gentemplat, die zu unterschiedlichen Zuständen der Genexpression und des gene-silencing führen
Welche Modifikationsenzymarten gibt es?
writer enzyme: Proteine die Modifikationen setzen
reader enzyme: Proteine,die Modifikation erkennen und daran binden um den Effekt umzusetzen
eraser enzyme: Proteine, die Modifikationen entferne
Wodurch ist die Nukleosomenpositionierung bestimmt?
- DNA Sequenz (jede Sequenz hat für das Histon eine Stelle mit Bindepräferenz)
- Chromatin remodeler (ATPasen): Proteinkomplexe im Zellkern, die in-vivo die Position der Nukleosomen verändern → chromatin remodeling
Was bedeutet DNA-Methylierung?
Generierung von 5’-Methylcytosin durch DN-Methyltransferasen (DNMT)
Wo wird gehäuft methyliert?
Bei GC-Dinukleotiden: Cytosin wird auf beiden Seiten symmetrisch methyliert (CpG-Methylierung)
- wird nach der Replikation speziell erkannt und die Hemimethylierte Stelle methyliert
Wann passiert die Demethylierung?
passiv bei Replikation (Hemimethylierung)
aktiv über 5hmC (5’-hydroxymethyl Cytosin) →werden später über BER entfernt
Welche Rolle spielt die Methylierung bei CpG-Inseln?
- Gen ist aktiv, wenn Inseln demethyliert
- Gen ist inaktiv, wenn Inseln methyliert sind
