F18

Question 1

hvad er aseptic teknik?

Answer 1

en måde at overføre mikrober mellem vækstmedia uden at forurene.

Question 2

hvordan foregår aseptic teknik?

Answer 2

En måde at udbrede mikrobielle kulture
- Består af flere trin
- Mikrober overføres mellem vækstmedia uden at forurene.
- Forurening kan komme via luft (luft dråber) eller fra overflader

Formålet med aseptic teknik
- Holde kulture rene
- Sørge for at tjekke om lab er rent

1. sterilisere loop ved brug af ild
2. låg fra kultur fjernes
3. sterilisere prøves overflade ved brug af ilt ved prøvens åbning, der hvor låget har siddet.
4. kun toppen af loopen kommer ned i prøven
5. prøven steraliseres igen ved brug af ild.
6. prøvens låg påsættes.
   Disse trin gentages ved nyt medium (loop steraliseres efter hver gang)

Overføre flydende kultur
1. loop steraliseres
2. loop udtager inoculum fra prøven
3. forskellige streger og linjer påføres i agar brønden.

Question 3

hvad er et pathogen?

Answer 3

Mikrober som forårsager sygdom

Både virus og bakterier

Question 4

hvad er binary fission?

Answer 4

Betyder at to celler kommer fra én celle.

1. en celle bliver elongeret (bliver længere) til dobbelt længde
2. der sker spetum (celle deling), dette fortsætter ind til to datterceller er adskilte fra hinanden
3. spetum er afsluttet. Der er skabt to datterceller (en ny generation)

Cellerne er genetisk identiske

Mikrober har forskellige generationtime hos de forskellige slags. Nogle tager 10 minutter, andre tager flere måneder eller længere.

Question 5

hvilke typer af celler laver binary fission?

Answer 5

prokaryoter

Question 6

hvad er en koloni?

Answer 6

Mange millioner af mikroorganismer på et sted (f.eks. i et cultur medium)
Kan ses med det blotte øje.

Question 7

hvad er generation tid (fordobblingstid)

Answer 7

(fordobblingstid): tiden det kræver at skabe én ny generation.

Question 8

hvad er kompleks medium?

Answer 8

For mange mikroorganismer er viden om den specifikke komposition af medium ikke nødvendigt, hvorved komplekst medium kommer ind.

Består af fordøjet mikrobiel, animalsk eller planteprodukter så som mælkeproteiner, kød, sojabønner, gærekstrakt og andre næringsrige substanser.

Disse komplekse medium sælges som dehydreret, hvor der tilsættes destilleret vand. Nemmeste medium at lave.

Kan være en ulempe, da man ikke kender den præcise komposition af medium.

Question 9

hvad er kultur medium?

Answer 9

Mikrooganismer vokser i cultur media, hvor næringssrige opløsninger er specialiserede i den specifikke mikroorganisme, som dyrkes.
Skal sterilieres før brug til dyrkning af mikroorganismer. Oftest bruges autoclave (varmbehandling)

Medium er oftest specificeret i forhold til den gældende mikroorganisme, for at den kan dyrkes i lab. Derfor er det vigtigt at kende til mikroorganismens fysiologi og nødvendige næringsstoffer, så man kan give den rette næring i rette form og mængde.

Der findes 2 forskellige slags cultur media.
1. defineret media
2. kompleks media

Medium
- Er en form for væske eller fast med blanding af næringsstoffer
- Disse næringsstoffer er mikroorganismerne afhængige af for at gro

Question 10

hvilke typer af kultur medium findes der?

Answer 10

defineret og kompleks media

Question 11

hvad består en kultur medium af?

Answer 11

blanding af næringsstoffer, som er tilpasaset den mikroorganisme man vil dyrke

Question 12

hvad er en kultur?

Answer 12

Betyder i dette sammenhæng mikrobiel cultur
- Samling er celler, som gror/vokser på samme næringsrige medium

Question 13

hvad kaldes en samling er celler, som gror/vokser på samme næringsrige medium

Answer 13

en koloni

Question 14

hvad er en eksponentiel vækst i data?

Answer 14

Ved eksponentiel fase sker der celledeling ved regulære intervaller hvor populationen stiger(generation time)

Ved indtastning af data ved denne fase, laves en eksponentiel kurve (x er tid, y er antal celler). Ved indtastning af de samme data i logaritmisk skala (semilogaritmisk graf), ses en lineær kurve. Denne logaritmiske kurve afspejler, at celler vokser eksponentielt og at populationen fordobles ved et konstant tidsinterval.

g=t/n
g=generation time,t=tid og n=generation.
Bruges til at bestemme generation time.

N_t=N_0 2^n
N_t=celleantal af t(tid)
N_0=antal celler ved tid 0
2^n=n er antal generation ved
perioden af eksponentiel vækst.

Kan løses ved
n=[(log⁡(N_t )-log⁡(N_0 ) )/log⁡(2) ]
Derved kan man beregne generation time ved brug af målbare kavantitative værdier N0 og Nt.

log⁡(2)=0,301

Skal kunne denne ligning
g/t=(log⁡(N_t )-log⁡(N_0 ))/0,301
g=generation time
t=tid
N_t=celleantal af t(tid)
N_0=antal celler ved tid 0

Skal kunne denne ligning

Question 15

hvordan beregnes generationstid?

Answer 15

g = t/ n

Question 16

hvad står g for?

Answer 16

generationstid (fordobblingstid)

Question 17

hvad står t for?

Answer 17

tid

Question 18

hvad står n for?

Answer 18

generation

Question 19

hvordan beregnes antal celler for et bestemt tidspunkt?

Answer 19

N_t = N_0 2^n
N_t=celleantal af t(tid)
N_0=antal celler ved tid 0
2^n=n er antal generation ved
perioden af eksponentiel vækst.

Question 20

hvad står N for?

Answer 20

antal celler

Question 21

hvilken formel skal jeg kunne?

Answer 21

log⁡(N )= log⁡(2) / g * t + log⁡(N_0 )

g kan udregnes ved at

g = log(2) / slope(hældning)

Question 22

hvad er growth(vækst)?

Answer 22

Betyder øgning af celleantal, som kommer af celledeling.
En enkelt celle kan dele sig ved hjælp af cultur medium og dele sig til mange milioner af mikroorganismer (koloni)

Question 23

hvad er en vækstkurve?

Answer 23

Mikrober vokser oftest ikke under optimale forhold i lab.

Vækstkurve: en batch af mikrober vokser efter en vækstcyklus, som kaldes mikrobiel vækst kurve

Er inddelt i 4 faser
1. lag fase
2. eksponentiel fase
3. stationær fase
4. decline fase

Question 24

hvordan er en vækst kurve delt op?

Answer 24

i lag fase, eksponentiel fase, stationær fase og decline fase

Question 25

hvad er lag fase?

Answer 25

Fasen, hvor celler er blevet flyttet til et frisk medium.
- Sker efter inokulation og før vækst
- Der sker ingen celledeling
- Celler skal tilpasse sig det nye miljø. Dvs. de skal tilpasse deres metaboliske stadie for at kunne leve i det nye miljø
- Lagfase er afhængig af celletype, om det er nye eller gamle kultur, hvilken medium de er i etc.

Ved kultur flytte fra et medium til et nyt, som har de samme forhold som det gamle, skal cellerne ikke tilpasse sig meget og derved kort lagfase.

Jo ældre kultur, jo længere lagfase

Ved flytning af kultur fra næringsrig medium til næringsfattig medium ses lang lagfase, da cellerne skal tilpasse sig det nye miljø.

Jo flere enzymer og molekyler en celle skal danne, jo længere er lagfasen.

Question 26

hvad går den eksponentielle fase ud på?

Answer 26

Perioden, hvor der sker celledeling (binary fission) ved regulær intervaller.
Kaldes også balanced growth, da celler så tætte på at være metabolsk ens i denne periode.

Derved bruges celler i eksperimenter, som er fra eksponentiel fase, da de er mest ens på dette tidspunkt.

Eksponentiel fase varierer meget fra de forskellige mikrober.
Medium, vækstforhold og cellen selv har afgørende betydning for den eksponentielle fase.

Den eksponentielle fase fortsætter indtil der ikke længere kan ske celledeling.

Question 27

hvad går den stationære fase ud på?

Answer 27

Når celledeling er ævivalent med celledød indtræfer stationær fase, hvor cellerne prøver at opretholde populationen.
Dvs. vækstrate er nul.

Sker ved
- Mangel på næring
- For stor mængde af affaldsprodukter fra celler.

Cellernes metabolismer skifter fra vækst til opretholdelse af population.

Question 28

hvad går decline fase ud på?

Answer 28

Når celledeling er mindre end celledød (flere celler dør end deler sig)
Populationen mindskes.
Nogle celler kan leve af døde celler (kryptisk vækst), hvor nogle subpopulationer kan leve kannibalistisk og genbruge ressorucer fra døde celler.

Question 29

hvad er define medium?

Answer 29

Laves ved specifikke målinger af ren uorganisk eller organiske kemikalier til destileret vand

Derved kender man til den præcise komposition af det definerede medium (både kvalitativ og kvantitativ)

Carbonkilde er den vigtigste kilde, da alle celler bruger carbon i store mængder for at danne nyt cellemateriale.
Dvs. carbonkilden afgøres af den specifikke mikroorganisme som skal dyrkes.

Question 30

hvad er diluting samlpe?

Answer 30

Prøver indeholder mange tusinder/millioner af viable bakterier. Ved at fortynde prøven kan man få et antal bakterier, som man kan tælle.
Oftest bruges serie af 10-fold dilution for at lave viable plate counts.

Ved tætte (dense) kulture, laves flere fortyndinger, for at kunne lave et reelt antal kolonier, man kan tælle.

For at kunne bestemme antal celler i en prøve, vil antal af observerede kolonier divideres med antal af prøver plader (sample plated).
Dvs. ved 1 mL af 1000-fold dilution er plated, dette er ækvivalent med plating 0,001 mL af den originale prøve.

For at kunne finde antallet af celler i prøven. Tager man det observerede antal kolonier og ganger det med fortyndingsfaktoren. F.eks. 159 observerede kolonier i et 10^3 fortyndingsfaktor (man har fortyndet den originale prøve 1/10^3 = 10^-3 .

Man skal ofte lave flere fortyndinger, ved ukendt antal celler i prøven for at kunne sikre sig et antal celler, man kan tælle.

Question 31

hvad er en growth factor?

Answer 31

Er organiske næringsstoffer, ofte er vitaminer de mest nødvendige growth factor

Er organiske mikronæringsstoffer (metal er uorganisk)

f.eks. vitaminer er en growth factor

Question 32

hvad er gut microbiome?

Answer 32

Mennesker
- Kan ikke selv danne enzymer til nedbrydning af komplekse carbohydrider (stivelse etc.)
- Mennesker er afhængige af mavemikrober
- Der er færrest mikrober ved øverste del af fordøjelsessystemet og flest ved endetarmen.
Disse mikrober syntiserer vitaminer, nedbryder komplekse saccharider og andre ting, som mennesker af afhængige af.

Question 33

hvad er medium (plural, media)?

Answer 33

Findes som fast eller flydende

Cultur medium solidificeres af agar (algal polyssacharid)

Fast medium immobiliserer celler, så de gror og deler sig i en bunke, som gør dem synlige som kolonier (isolerede cellemasse som er synlig)
Kolonier er forskellige ud i forhold til mikroorganismerne (mht. cultur forskellige, næringskilde og fysiologiske paramenter), hvorved man oftest kan skelne mellem forskellige mikroorganismer i forhold til deres kolonis udseende.

Question 34

hvad er koloni morfologi?

Answer 34

Bruges til at skelne mellem mikroorganismer
Bruges almindeligt til at bestemme om en kultur er ren (kun hvis én mikrobe er tilstede). Er forurenet (uønskede mikroorganismer er tilstede sammen med den ønskede organisme) eller er blandet (mixed) (mande mikrober er tilstede)

Plader podet med mixed kultur (så som naturlige prøver) eller fra forurenet rene kulture vil oftest vise flere end én koloni type.

Question 35

hvad er microorganism?

Answer 35

Eller mikrober
- Livsformer, som er for små til at ses med det blotte øje
- Mange er udefinerede enkelt cellede organismer
- Andre har komplekse strukture
- Nogle er multicellulær

Mikroorganismer består af
- Carobn
- Oxygen
- Nirogen
- Hydrogen
- Phosphat
- Svovl
Disse atomer består alle mikrober af

• Kalium
• Natrium
• Calcium
• Magnesium
• Chlor
• Jern
  Disse elementer er nødvendige for de fleste mikrober

Microbial communities:
- Nogle mikroorganismer lever i samfund/grupper)
- Her reguleres deres aktivitet af interaktioner med hinanden, omgivelserne og andre organismer

De er en stor del af jordens mangfoldighed og biodiversitet
Ilt (oxygen) kommer af mikrobiel aktivitet

Mikroorganismers evner
- Er essentielle for menneskers liv og vigtige funktioner på jorden

Legumes lever i symbiose med bakterier
- Bakterierne sidder i nodules ved rødderne
- Bakterierne konverterer atmofærisk nitrogen (N2) til ammoniak (NH3) via nitrogen fiksering.
- Ammoniak er vigtig næringsstof i gødning

Bakterier regulerer næringsscyklus i jord og gennem biospheren, hvor de transformerer og genbruger næringsstoffer, der er nødvendige for planter og dyr

Drøvtyggere
- Mangler enzym til at nedbryde planters cellevæg (cellulose)
- I rumen hos drøvtyggere bliver polyssacharid cellulose nedbrudt og fermenteret af mikroorganismer
Drøvtyggere får deres næringsstoffer ved metaboliering af restprodukterne fra mikroorganismerne i rumen og ved fordøjelse af døde mikroorganismer.

Question 36

hvad er viable celelr?

Answer 36

Levende celler, som er i stand til at dele sig.

Question 37

hvad er viable count?

Answer 37

plate count

Spreder mikrober på fast media og tælle kolonier. (kan også kaldes plate count, da agarplader kræves)

Er en sensitiv metode, da man kan finde så få som én enkel viable celle pr. prøve. Kan bruges til at finde uønskede mikrober i vand og mad.

Man antager at hver viable celler vil vokse og dele sig til en enkel koloni, og derved koloniantal bruges som målestok for celle antal.

Metoder:
Spread plate count
- Opløst kultur er spred ud over overflade på agarplade

Pour plate count
- En kendt volumen af kultur er pippeteret ned i en tom steril petri plade.

Antallet af kolonier skal ikke være for mange eller for få. Ved mange kolonier på en plade, kan kolonier fusionere (ikke rigtig antal)
Ved for få kolonier vil den statistiske vigtighed for den beregnede antal være lav.

• Oftest vil en valid statistik være, at der er mellem 30-300 kolonier på en plade.

Question 38

hvad er plate count?

Answer 38

viable count

Question 39

hvad er total celle count?

Answer 39

Tælle mikrobielle antal
Giver en kvantitativ information om stadiet af labs mikrobielle kultur eller mikrobielle community i naturen.

Er en nem måde at estimere mikrobielle cellers antal.

Ulemper:
- Ved forkert teknik i farvning, kan man ikke adskille levende celler fra døde
- Svært at se små celler under mikroskop.
- Celleopløsninger med lav densitet kan have for få celler (eller ingen) i mikroskopets synsfelt, hvis ikke opløsningen ikke er koncentreret.
- Motile celler skal dræbes (oftest med formaldehyd) eller immobiliseres inden tælling
- Affald i prøven kan nemt forveksles med celler.

Man observerer og enumeraterer celler tilstede. Ved brug af mikroskopisk celle tælling.
- Kan udføres på tørre prøver på slides
- Eller udføres på flydende prøver

Tørre prøver
- Kan farves for at øge kontrasten melle celler og baggrund.
- Fase-kontrast er essentiel for observering af ufarvet præperater.

Flydende prøver
- Tælle kamre i gitter, som man kender areal af, revet på overflade af glas slide.
- Et coverslip påsættes, hvorved man kender hver huls (firkant i gitter) volumen.
- Antal af mikrober pr. volumen
- Antal af mikrober pr. milimeter i opløsningen kan beregnes ved brug af konversion factor baseret på volumen af kamre prøver.

Question 40

hvad er Monitoring bacterial cell growth in the laboratory (ikke så vigtigt)

Answer 40

Mikrobielle celler kan sprede lys. Dvs. den mængde lys, som er spredt i en opløsning, er proportional til antallet af celler tilstede i prøven.

En prøve ser mælket ud (turbid) fordi celler spreder lys, som kommer ind i prøven.

Turbidity: måler spredning af lys og derved kan beregne antal celler i en prøve.

Måles med spektrofotometer
- Måler spredning af lys
- Sensitivitet er bedst ved kort bølgelængde
- Måle i tætte prøver er bedst at bruge længere bølgelængder for mere præcision.
- Unicellulkære organismer: optisk tæthed er proportional med celleantal (til hvis grænse)
- Dvs. Turbidity kan bruges som ekstra metode for at finde antal celler i prøve.

Før man måler Turbidity, skal man have lavet en standart kurve ved hjælp af mikroskopi eller viable count. Den linære proportionalitet stopper, når prøver med mange celler i spreder lys, så når en celle spreder lys, vil dette lys ramme en anden celle, som spreder det samme lys. Dvs. måling af Turbidity kan ikke angive det korrekte antal celler.

Fordele:
- En hurtig og let måde at estimere antal celler i prøve
- Man forstyrre eller dræber ikke celler
Dvs. kan bruges til at observation af antal celler over tid.