F16

Question 1

hvad er proteome?

Answer 1

Kommer af protein expressed by the genome

Proteome fortæller om hvilke proteiner, som er funktionelt til stede.

Proteome er ikke fast karakteristik af celle

Proteome repræsenterer den funktionelle expression af information, som varierer hos celletype, udvikling stadie og miljø forhold (f.eks. tilstedeværelse af hormoner)

Proteomers information kan findes ved at isolere, karakterisere proteiner samt cataloginere proteiner

Question 2

hvad er assay?

Answer 2

En metode for at måle aktivitet af enzym
Proteinet skal isoleres pba. deres kemiske egenskaber

Man måler efter hvert trin af purification, for at se om purification virker.

Dvs. assay fortæller om hvor meget enzymaktivitet, der er tilstede.

Man skal kende koncentrationen af enzym,

Question 3

hvad menes der med specifik aktivitet?

Answer 3

Forholdet mellem enzymaktivitet i forhold til mængden af protein. Ved hvert trin af purification.

Question 4

hvad betyder purification?

Answer 4

betyder oprensning

Question 5

hvad gør molecular exclusion chromatography?

Answer 5

Separation via størrelse
I en sølje med blanding af proteiner tilsættes perler, som vil skærme for de største proteiner kan kommer ind i internal volumen. Dvs. de største molekyler vil kommer ud af først.

Små molekyler kan gå ind i disse perler, mens de store kan ikke pga. af størrelse,

Question 6

hvilken metode laver separation via størrelse?

Answer 6

molecular exclusion chromatography

og

gel elektroforese

Question 7

hvad gør ion-exchange chromatography?

Answer 7

En måde at separere proteiner pba. Deres net ladning.

Hvis en ion ved pH 7 har positiv ladning vil den binde til en column af perler som indeholder negativ ladet carboxylationer. Dvs. positiv tiltrækkes af negativ.

Men hvis en ion ved pH 7 har en negativ ladning, vil den ikke binde til en column og derved kommer hurtigere ud af søjlen, da de ikke bindes til noget.

Question 8

hvilken metode laver separation på net ladning

Answer 8

ion-exchange chromatography

Question 9

hvad gør affinity chromatography?

Answer 9

Bruges til at isolere proteiner

Bruger fordelen ved, at nogle proteiner har en høj affinitet for specifikke kemiske grupper eller specifikke molekyler

f.eks. ved en søjle med glucosebindende protein er bundet til glucose residues på perler.
Ved tilsætning af glucose, vil glucosebindende proteiner blive frigivet pga. tilførslen af glucose
Derved har man fået frie glucosebindende proteiner

Question 10

hvilken metode laver separation af proteiner ved brug af affinity?

Answer 10

affinity chromatography

Bruger fordelen ved, at nogle proteiner har en høj affinitet for specifikke kemiske grupper eller specifikke molekyler

Question 11

hvad er gel elektrophoresis ?

Answer 11

En måde at separere proteiner på efter størrelse.

• Alle proteiner skal være negativ ladet som styres af pH
• Et molekyle med net ladning vil bevæge sig over et elektrisk fælt (fænomen kaldet elektrophoresis)
• Hastigheden og længden af protein bevæger sig med styre elektro-felt styrken, net ladning på proteinet (som er en funktion af pH af elektrophoretiske opløsning) og strukturen af proteinet.

Udføres i gel, med porer i, som proteinerne kan bevæger sig gennem og øger separetionen.

De bevæger sig fra cathode (negativ ladning) mod anode (positiv ladning)

De mindste ladede molekyler bevæger sig længst, mens de største molekyler bevæger sig mindst.

Question 12

hvilken metode bruger gel til at lave adskillelse af proteiner?

Answer 12

gel elektrophorese

Question 13

hvad gør western blotting?

Answer 13

Immunoassay teknik (også kaldet immunplotting)

Kan identificere specifikke proteiner i en væske.
Tillader også bestemmelse af størrelse af det specifikke protein.

Substratet udsættes for elektrophoresis på en SDS-polyacrylamid gel for at separere de individuelle proteiner

De viste proteiner på gelen overføres til en polymer sheet, hvor der tilføres flourescenlty labeled specifik antibodies.

Derefter vaskes sheetet for at fjerne overskydende antibodies

Polymersheet bliver udsat for antibody, hvor de reagerer med antibodies

Derefter belyses det med eksiteret lys og derved kan man se de antibodies, som har bundet sig til protein pga. fluorescensen.

Derved kan man på et immunplot se et bånd pga. flour, som viser det specifikke protein.

Question 14

hvad gør mass spectrometry

Answer 14

En måde at analysere ioniserede former af molekyler på gasform

Masse information opnås ved bestemmelse af, hvor meget en ion accelererer over et elektrisk felt.

Ved sammenligning af 2 forskellige molekyler med samme ladning men forskellig masse.
De samme kræfter vil virke på dem, men accelerationen på den lette af molekylerne vil være større pga. Newtons 3 lov.

Question 15

hvad er cDNA?

Answer 15

Er samling af DNA sekvenser, som repræsentere alt mRNA en celle kan udtrykke

For at kunne finde et protein, skal man bruge en probe (kemisk stof) som kan genkende proteinets DNA
Man skal kun kende den primære struktur for proteinet, da man derved kan syntisere det korresponderende DNA sekvens til aminosyresekvensen.

Question 16

hvad gør reverse transcriptase enzym?

Answer 16

Et enzym
Bruger mRNA som template til at lave DNA kopier eller cDNA

Question 17

hvad er complementary DNA (cDNA)?

Answer 17

cDNA vil indeholde den samme information som DNA, men hvor intronsekvenserne er splejset væk. Introns er den ikke-kodende del af DNA/RNA.

cDNA syntiseres ved at DNA er blevet transkriberet fra et specifikt mRNA ved brug af reverse transkriptase enzym.

Question 18

hvad gør restriktion enzym?

Answer 18

Er en enzym, som genkender basesekvenser i dobbelt helixer DNA og kløver specifikke steder på begge strenge af dobbelthelixen.

Hos bakterier er dens rolle at fjerne udfrakommende DNA ved at kløve det. Cellens eget DNA er methyleret og derved genkender enzymet det som sit eget og derfor kløver ikke.

Question 19

hvad er en vector?

Answer 19

DNA stykket, hvor en DNA-sekvens, som koder for noget, sat ind i et DNA stykke

En vectors egenskab er at den kan tages af enhver vært og repliceres automatisk i værten.

En bakterie får indsat dette stykke DNA og replikere dette. Man kan derefter isolere bakterien og få den til at danne mange kopiere af det DNA sekvens, man gerne vil have som protein.

Question 20

hvad er et plasmid?

Answer 20

Cirkler af DNA hos bakterier, som agerer chromosom for dem.

Ved et plasmid kan et restriction enzym kløver en DNA sekvens ud af plasmidet ved specifik site
Der laves staggered cuts producere komplementær single-stranded ender, som har en specifik affinitet for hinanden og derved kendes som sticky end. Derefter kan et ønsket DNA fragment kløves af restriction enzymet til ønsket længde, hverefter det sættes ind i plasmidet ved hjælp af DNA ligase.

Question 21

hvor finder man plasmider?

Answer 21

hos bakterier

Question 22

hvad er sticky ends?

Answer 22

Staggered cuts producere komplementær single-stranded ender, som har en specifik affinitet for hinanden og derved kendes som sticky end.

Skabes af restrictions enzym på plasmid

Question 23

hvad gør DNA ligase?

Answer 23

Et enzym, som sætter plasmidet sammen med DNA fragmentet i forhold til stickey ends.

Question 24

hvad er ekspression vector?

Answer 24

Plasmider eller phager, som vil favorisere indsatte DNA molekyler og vil udtrykke dem effektivt.
De vil maksimere transskriptionen af det indsatte DNA ved brug af stærk promotor
Expression vektor kan også indeholde DNA segment, som koder for ribosombindingssted på mRNA, som er transskriberet fra det indsatte cDNA

Question 25

Hvad er PCR?

Answer 25

En cyklus, hvor DNA syntiseres
En amplikation sproces

1. streng separation
   DNA dobbelthelix bliver separeret ved varme på 95 grader i kort tid
2. hydrolyse af primer
   opløsningen bliver kølet ned til 54 og derved tillader primer at hybridisere sig til DNA-strenge. Hver primer hybridisere til 3´-enderne på strengene.
3. DNA syntese
   Opløsningen varmes op igen til 72, optimale temp. For Taq DNA polymerase. Dette enzym elongerer primerne i retningen af target DNA sekvens. (retning altid 3´-> 5´)

Elongering sker på begge strenge, men går ud over DNA sekvens (længere end det)

Question 26

hvornår bruges PCR?

Answer 26

PCR (Polymerase Chain Reaction) er en molekylærbiologisk teknik, der bruges til at amplificere (kopiere) små mængder DNA, så de kan analyseres nærmere. Denne metode blev udviklet i 1983 af Kary Mullis og har siden revolutioneret genetikforskning og diagnostik.

Metode:
PCR består af flere cyklusser, der gentager sig selv, hvilket resulterer i eksponentiel forøgelse af den specifikke DNA-sekvens, man ønsker at undersøge. De vigtigste trin i PCR-processen er:

Denaturering (94–98°C): DNA’et smelter og adskilles i to enkeltstrenge, da hydrogenbindingerne mellem baserne brydes.

Annealing (50–65°C): Temperaturen sænkes, så specifikke kortere DNA-sekvenser kaldet primere kan binde sig til de enkeltstrengede DNA-molekyler. Primere er korte DNA-sekvenser, der flankerer den region, man vil amplificere.

Elongering (72°C): DNA-polymerase (oftest Taq-polymerase, som stammer fra en varmetolerant bakterie) tilføjer nukleotider og forlænger de nye DNA-strenge ved at følge de enkeltstrengede skabeloner.

Disse trin gentages normalt 20-40 gange, hvilket resulterer i en massiv forøgelse af mål-DNA’et.

Hvornår bruges PCR?
PCR bruges i mange forskellige sammenhænge, blandt andet:

Diagnostik: PCR kan bruges til at påvise infektioner som f.eks. COVID-19, HIV, tuberkulose og mange andre sygdomme. Teknikken gør det muligt at detektere selv små mængder virus-DNA eller bakterie-DNA.

Genetisk forskning: PCR anvendes til at isolere specifikke gener, studere mutationer, eller analysere DNA fra f.eks. forfædre (som i genetik og slægtsforskning).

Arvelige sygdomme: Ved at amplificere bestemte DNA-sekvenser kan man finde genetiske mutationer, der er forbundet med arvelige sygdomme.

Kort sagt er PCR en hurtig og effektiv metode til at producere store mængder DNA fra en lille prøve, hvilket gør det muligt at analysere DNA for en lang række formål.

Question 27

hvad er agarogel?

Answer 27

En form for gel elektroforese
Bruges til at separerer makromolekyler så som DNA eller andet protein

Agar er et af hovedkomponenterne

De kan adskilles ved størrelse, ladning eller fragment længde (DNA og RNA)

Er ofte brug i lab

Question 28

hvad er DNA sekventering?

Answer 28

DNA-sekvensering er en metode til at bestemme den nøjagtige rækkefølge af nukleotider (A, T, C, G) i et DNA-molekyle.

Metode: Den mest anvendte metode er Sanger-sekvensering, hvor DNA’et deles op i mindre fragmenter, der kopieres og analyseres ved hjælp af specielle mærkede nukleotider, som stopper kædereaktionen på bestemte steder. Derudover anvendes nyere metoder som next-generation sequencing (NGS), der gør det muligt at sekvensere store mængder DNA hurtigt og effektivt.

Anvendelser: DNA-sekvensering bruges til at kortlægge genomer, identificere genetiske sygdomme, undersøge genetisk variation og forstå evolutionære relationer. Det er også vigtigt i medicinsk diagnostik, for eksempel i kræftforskning og personlig medicin.

Question 29

hvad er restriktionsskæring?

Answer 29

Restriktionsskæring er en metode, hvor specifikke enzymer, kaldet restriktionsenzymer, bruges til at klippe DNA-molekyler ved bestemte sekvenser af nukleotider.

Metode: Restriktionsenzymer genkender og skærer DNA ved specifikke palindromiske sekvenser (f.eks. GAATTC for enzyme EcoRI). Hver type restriktionsenzym har en unik genkendelsessekvens. Når enzymet klipper, kan det skabe enten lige eller “klæbrige” ender, der kan bruges til videre manipulation.

Anvendelser: Restriktionsskæring bruges til DNA-kloning, kortlægning af genomer, opdeling af DNA til analyse, fremstilling af rekombinante DNA-molekyler og i genetikforskning. Det anvendes også i diagnostik og for at isolere specifikke gener.

Question 30

hvad er Reverse transcibering ?

Answer 30

Metode: Enzymet reverse transcriptase bruges til at omdanne RNA til cDNA (komplementært DNA).
Anvendelse: Bruges til at studere genekspression ved at omdanne mRNA til cDNA, som derefter kan analyseres ved PCR eller sekvensering.

Question 31

hvad er ligering?

Answer 31

Metode: Ligase-enzymer bruges til at forbinde to DNA-strenge ved at skabe fosfodiesterbindinger mellem dem.
Anvendelse: Bruges i DNA-kloning for at indsætte et gen i et vektor-DNA eller til at reparere

Question 32

hvad er SDS-PAGE?

Answer 32

Metode: En type gelelektroforese, hvor proteiner separeres efter størrelse ved hjælp af Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), som giver dem en negativ ladning.
Anvendelse: Bruges til at adskille og analysere proteiner, vurdere deres størrelse og renhed.

Question 33

hvad er rekombinant protein ekspression?

Answer 33

Metode: Generering af proteiner i en vært (ofte bakterier som E. coli) ved at indsætte et gen i et vektor-DNA, som derefter ekspresserer proteinet.
Anvendelse: Bruges til at producere store mængder af proteiner til forskning, diagnostik og terapeutiske formål.

Question 34

hvad er proteinoprensning?

Answer 34

Metode: Isolering af proteiner fra celler ved hjælp af kemiske, fysiske eller enzymatiske metoder (f.eks. sonikering, centrifugering).
Anvendelse: Bruges til at opnå rene proteiner til videre analyse eller anvendelse i eksperimenter.

Question 35

hvad er strukturelle studier?

Answer 35

Metode: Isolering af proteiner fra celler ved hjælp af kemiske, fysiske eller enzymatiske metoder (f.eks. sonikering, centrifugering).
Anvendelse: Bruges til at opnå rene proteiner til videre analyse eller anvendelse i eksperimenter.

Question 36

hvad er aktivitetsassay?

Answer 36

Metode: Eksperimentelle metoder, hvor en bestemt enzymaktivitet eller biologisk funktion måles, f.eks. ved at monitorere produktdannelse eller ændringer i reaktionens hastighed.
Anvendelse: Bruges til at studere enzymers funktion, inhibering, eller interaktion med substrater, hvilket er essentielt i biokemisk forskning og lægemiddeludvikling.