F16 Flashcards
Experimental techniques
hvad er proteome?
Kommer af protein expressed by the genome
Proteome fortæller om hvilke proteiner, som er funktionelt til stede.
Proteome er ikke fast karakteristik af celle
Proteome repræsenterer den funktionelle expression af information, som varierer hos celletype, udvikling stadie og miljø forhold (f.eks. tilstedeværelse af hormoner)
Proteomers information kan findes ved at isolere, karakterisere proteiner samt cataloginere proteiner
hvad er assay?
En metode for at måle aktivitet af enzym
Proteinet skal isoleres pba. deres kemiske egenskaber
Man måler efter hvert trin af purification, for at se om purification virker.
Dvs. assay fortæller om hvor meget enzymaktivitet, der er tilstede.
Man skal kende koncentrationen af enzym,
hvad menes der med specifik aktivitet?
Forholdet mellem enzymaktivitet i forhold til mængden af protein. Ved hvert trin af purification.
hvad betyder purification?
betyder oprensning
hvad gør molecular exclusion chromatography?
Separation via størrelse
I en sølje med blanding af proteiner tilsættes perler, som vil skærme for de største proteiner kan kommer ind i internal volumen. Dvs. de største molekyler vil kommer ud af først.
Små molekyler kan gå ind i disse perler, mens de store kan ikke pga. af størrelse,
hvilken metode laver separation via størrelse?
molecular exclusion chromatography
og
gel elektroforese
hvad gør ion-exchange chromatography?
En måde at separere proteiner pba. Deres net ladning.
Hvis en ion ved pH 7 har positiv ladning vil den binde til en column af perler som indeholder negativ ladet carboxylationer. Dvs. positiv tiltrækkes af negativ.
Men hvis en ion ved pH 7 har en negativ ladning, vil den ikke binde til en column og derved kommer hurtigere ud af søjlen, da de ikke bindes til noget.
hvilken metode laver separation på net ladning
ion-exchange chromatography
hvad gør affinity chromatography?
Bruges til at isolere proteiner
Bruger fordelen ved, at nogle proteiner har en høj affinitet for specifikke kemiske grupper eller specifikke molekyler
f.eks. ved en søjle med glucosebindende protein er bundet til glucose residues på perler.
Ved tilsætning af glucose, vil glucosebindende proteiner blive frigivet pga. tilførslen af glucose
Derved har man fået frie glucosebindende proteiner
hvilken metode laver separation af proteiner ved brug af affinity?
affinity chromatography
Bruger fordelen ved, at nogle proteiner har en høj affinitet for specifikke kemiske grupper eller specifikke molekyler
hvad er gel elektrophoresis ?
En måde at separere proteiner på efter størrelse.
- Alle proteiner skal være negativ ladet som styres af pH
- Et molekyle med net ladning vil bevæge sig over et elektrisk fælt (fænomen kaldet elektrophoresis)
- Hastigheden og længden af protein bevæger sig med styre elektro-felt styrken, net ladning på proteinet (som er en funktion af pH af elektrophoretiske opløsning) og strukturen af proteinet.
Udføres i gel, med porer i, som proteinerne kan bevæger sig gennem og øger separetionen.
De bevæger sig fra cathode (negativ ladning) mod anode (positiv ladning)
De mindste ladede molekyler bevæger sig længst, mens de største molekyler bevæger sig mindst.
hvilken metode bruger gel til at lave adskillelse af proteiner?
gel elektrophorese
hvad gør western blotting?
Immunoassay teknik (også kaldet immunplotting)
Kan identificere specifikke proteiner i en væske.
Tillader også bestemmelse af størrelse af det specifikke protein.
Substratet udsættes for elektrophoresis på en SDS-polyacrylamid gel for at separere de individuelle proteiner
De viste proteiner på gelen overføres til en polymer sheet, hvor der tilføres flourescenlty labeled specifik antibodies.
Derefter vaskes sheetet for at fjerne overskydende antibodies
Polymersheet bliver udsat for antibody, hvor de reagerer med antibodies
Derefter belyses det med eksiteret lys og derved kan man se de antibodies, som har bundet sig til protein pga. fluorescensen.
Derved kan man på et immunplot se et bånd pga. flour, som viser det specifikke protein.
hvad gør mass spectrometry
En måde at analysere ioniserede former af molekyler på gasform
Masse information opnås ved bestemmelse af, hvor meget en ion accelererer over et elektrisk felt.
Ved sammenligning af 2 forskellige molekyler med samme ladning men forskellig masse.
De samme kræfter vil virke på dem, men accelerationen på den lette af molekylerne vil være større pga. Newtons 3 lov.
hvad er cDNA?
Er samling af DNA sekvenser, som repræsentere alt mRNA en celle kan udtrykke
For at kunne finde et protein, skal man bruge en probe (kemisk stof) som kan genkende proteinets DNA
Man skal kun kende den primære struktur for proteinet, da man derved kan syntisere det korresponderende DNA sekvens til aminosyresekvensen.
hvad gør reverse transcriptase enzym?
Et enzym
Bruger mRNA som template til at lave DNA kopier eller cDNA
hvad er complementary DNA (cDNA)?
cDNA vil indeholde den samme information som DNA, men hvor intronsekvenserne er splejset væk. Introns er den ikke-kodende del af DNA/RNA.
cDNA syntiseres ved at DNA er blevet transkriberet fra et specifikt mRNA ved brug af reverse transkriptase enzym.
hvad gør restriktion enzym?
Er en enzym, som genkender basesekvenser i dobbelt helixer DNA og kløver specifikke steder på begge strenge af dobbelthelixen.
Hos bakterier er dens rolle at fjerne udfrakommende DNA ved at kløve det. Cellens eget DNA er methyleret og derved genkender enzymet det som sit eget og derfor kløver ikke.
hvad er en vector?
DNA stykket, hvor en DNA-sekvens, som koder for noget, sat ind i et DNA stykke
En vectors egenskab er at den kan tages af enhver vært og repliceres automatisk i værten.
En bakterie får indsat dette stykke DNA og replikere dette. Man kan derefter isolere bakterien og få den til at danne mange kopiere af det DNA sekvens, man gerne vil have som protein.
hvad er et plasmid?
Cirkler af DNA hos bakterier, som agerer chromosom for dem.
Ved et plasmid kan et restriction enzym kløver en DNA sekvens ud af plasmidet ved specifik site
Der laves staggered cuts producere komplementær single-stranded ender, som har en specifik affinitet for hinanden og derved kendes som sticky end. Derefter kan et ønsket DNA fragment kløves af restriction enzymet til ønsket længde, hverefter det sættes ind i plasmidet ved hjælp af DNA ligase.
hvor finder man plasmider?
hos bakterier
hvad er sticky ends?
Staggered cuts producere komplementær single-stranded ender, som har en specifik affinitet for hinanden og derved kendes som sticky end.
Skabes af restrictions enzym på plasmid
hvad gør DNA ligase?
Et enzym, som sætter plasmidet sammen med DNA fragmentet i forhold til stickey ends.
hvad er ekspression vector?
Plasmider eller phager, som vil favorisere indsatte DNA molekyler og vil udtrykke dem effektivt.
De vil maksimere transskriptionen af det indsatte DNA ved brug af stærk promotor
Expression vektor kan også indeholde DNA segment, som koder for ribosombindingssted på mRNA, som er transskriberet fra det indsatte cDNA
