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JCBCM > BCM 1521 - 1 à 3 et 5 > Flashcards

BCM 1521 - 1 à 3 et 5 Flashcards

1
Q

Quelle est la première étape d’une extraction de protéine?

A

La lyse cellulaire

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Q

Comment fonctionne la lyse osmotique?

A

On place les cellules en solution hypotonique (peu de soluté) pour faire gonfler la cellule qui éclatera.

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3
Q

Quelle est la double activité des lysosymes?

A

Il dégrade la paroi cellulaire et il s’agit d’une petite protéines cationique qui perturbe la membrane.

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4
Q

Qu’est-ce que le SDS?

A

Du sodium dodecyl sulfate: il s’agit d’un détergeant capable de dissoudre les membranes et de dénaturer les protéines.

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5
Q

Qu’est-ce que la protéinase K?

A

Une protéase à sérine qui digère des protéines contaminantes.

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6
Q

Quels sont les propriétés physicochimiques des protéines qui nous permet de les purifier? (4)

A

-Solubilité: précipitation
-Charge ionique: chromatographie, électrophorèse, focalisation isoélectrique
-Taille moléculaire: ultracentrifugation, chromatographie sur gel, électrophorèse
-Spécificité: chromatographie d’affinité

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7
Q

Quels sont les facteurs de la solubilité d’une protéine? (3)

A
  1. interactions polaire avec la solution aqueuse
  2. Interactions ioniques avec les sels en solution
  3. Forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire
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8
Q

Quels sont les variations typiquement utilisés pour diminuer la solubilité d’une protéine? (5)

A
  1. La force ionique (sels)
  2. ajout de solvants organiques
  3. changements de températures
  4. Le pH
  5. ajout de polymères inertes
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9
Q

Qu’est-ce que le salting in?

A

Il s’agit d’augmenter une première fois la concentration en sel ce qui va:
-augmenter les interactions avec l’eau
-augmenter la répulsion entre les protéines

En gros augmentation de la solubilité aqueuse.

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9
Q

Est-ce que la nature du sel affecte le salting in/out

A

Oui

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10
Q

Qu’est-ce que le dessalage ou salting out?

A

Il s’agit d’augmenter énormément la concentration de sel pour que les ions salins compétition avec les protéines pour la solvatation. (accès aux molécules d’eau)

Les régions hydrophobes des protéines vont devenir exposés ce qui favorisera l’agrégation protéique.

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10
Q

Qu’est-ce qu’un agent chaotropique?

A

Un agent de désordre qui interagit directement avec la protéine, ce qui peut la déstabiliser.

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11
Q

Qu’est-ce qu’un agent kosmotropique?

A

Un agent structurant qui va favoriser l’hydratation des régions polaires de la protéine et la déshydratation des régions hydrophobes.

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12
Q

Quel est la sel idéal pour la précipitation de protéines?

A

Le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4

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13
Q

Est-ce que toutes les protéines se précipites à la même concentration de sel? Comment cela impacte la séparation?

A

Non,
Les protéines se précipites a différentes forces ioniques ce qui permet de les purifier d’autres protéines.

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14
Q

À quel pH une protéines est le moins soluble?

A

À sont point isoélectrique
Une protéines avec une charge globale de 0 va énormément diminuer les répulsions électrostatiques des protéines ce qui favorisera leur agrégations par interactions hydrophobes.

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15
Q

Comment l’utilisation de solvants organiques affectent la solubilité des protéines?

A

Les solvants organiques vont réduire la concentration d’eau qui interagiront avec les surfaces polaires de la protéines. Ces surfaces seront donc disponibles pour faire des interactions de charges opposés avec d’autres protéines, favorisant l’agrégation protéique.

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16
Q

Quelles sont les caractéristiques d’intérêt d’une protéine? (5)

A
  1. La localisation
  2. La forme
  3. La solubilité
  4. La grosseur
  5. Le pI
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17
Q

Comment se nomme une chromatographie qui utilise les charges?

A

Chromatographie par échange d’ions.
On utilise un support solide chargé qui vas cibler les sections chargées des protéines.
Le pH de l’éluant doit être contrôlé car il contrôle les charges électriques des protéines.

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18
Q

Comment se nomme une chromatographie qui utilise la taille?

A

Chromatographie par filtration sur gel

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19
Q

Comment se nomme une chromatographie qui utilise la spécificité?

A

Chromatographie d’affinité.
Elle utilise dans ligands qui vont se lier de manière covalente avec les protéines cibles.

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20
Q

Comment se nomme une chromatographie qui utilise l’hydrophobicité

A

chromatographie d’interactions hydrophobes

21
Q

Qu’est-ce qu’une chromatographie par échange d’anion?

A

Il s’agit d’une chromatographie par échange d’ion qui utilise un support chargé positivement.
Idéal pour isoler une protéine pouvant avoir beaucoup de charge négatives.

22
Q

Qu’est-ce qu’une chromatographie par échange de cation?

A

Il s’agit d’une chromatographie par échange d’ion qui utilise un support chargé négativement.
Idéal pour isoler une protéine pouvant avoir beaucoup de charge positive.

23
Q

Quelles sont les étapes d’une chromatographie d’échange d’ions?

A
  1. Équilibration: Établir les conditions de départ souhaité avec une solution tampon propre à la phase stationnaire.
  2. Chargement de l’échantillon et lavages: Mélanger l’échantillon dans un autre ou le même tampon pour le placer dans la chromatographie. Ensuite laver toute la chromatographie avec ce même tampon pour “laver” les molécules non liées.
  3. Élution: On change les conditions de l’éluant pour “laver” graduellement les protéines liées.
  4. Régénération: Un lavage qui va délier toutes les molécules prisent dans la résine.
24
Q

Qu’est-ce qu’une élution par gradient linéaire?

A

Une élution qui utilise un gradiant dont la concentration varie de manière constante et continue.

25
Q

Qu’est-ce qu’un élution par gradient fractionné?

A

Une élution qui utilise un gradient dont la concentrations change de manières drastiques.
Par “paliers” graphiquement

26
Q

Qu’est-ce qu’un dialyse? Quand est-ce qu’est-elle approprié?

A

Il s’agit d’une filtration des sels pour rediluer les protéines et, ou pour réduire la force ionique de la solution.

On en fait généralement une suite a un salting out.

27
Q

Est-il plus rapide de faire une dialyse dans un grand volume ou dans plusieurs petits volumes?

A

Dans plusieurs petits volumes

28
Q

À quoi servent les colonnes filtres?

A

À exclure des molécules en fonction de leur taille par centrifugation.

29
Q

Est-ce les petites ou les grosses protéines qui se déplaces plus vites dans une chromatographie sur gel?

A

Les grosses protéines, car elles ne restent pas prisent dans la matrice des billes du gel.

30
Q

Comment la polymérisation de certaines protéines peuvent affecter leur déplacement dans une chromatographie sur gel ou dans l’électrophorèse PAGE?

A

Les protéines qui se polymérisent pour former des dimères, des tétramères, etc. vont augmenter leur taille et masse moléculaire moléculaire ce qui peut accélérer leur déplacement en chromatographie sur gel ou les ralentir en électrophorèse PAGE.

31
Q

Comment est-ce que l’on détache les protéines des ligands dans une chromatographie d’affinité?

A

En ajoutant des ligands libres dans l’éluant où en changeant les conditions de l’éluant (température, pH, etc.) pour réduire l’affinité du ligand.

32
Q

Qu’est-ce que Kd?

A

La constante de dissociation entre une protéine et un ligand.

33
Q

Qu’est-ce qu’une protéine de fusion?

A

Une protéine qui servira d’intermédiaire pour s’associer à la protéine a purifier et au ligand et qui sera facile a exciser par une protéase.

34
Q

Quelles sont les étapes de la chromatographie d’affinité avec un gel d’agarose?

A
  1. Réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène. (étherification du groupement hydroxy)
  2. Éluer les protéines et laisser les protéines ayant “RNH2” se lier.
35
Q

Qu’est-ce qu’un bras espaceur?

A

une chaine de ≈6 carbones liant le ligand à la matrice pour laisser de l’espace pour que la protéine puisse bien se lier au ligand.

36
Q

Quelle est la méthode idéale pour déterminer de la pureté d’une protéine suite à l’extraction?

A

Électrophorèse SDS-PAGE

37
Q

Quelles sont les deux forces impliquées dans une électrophorèse?
Laquelle est la plus forte?

A
  • La force de friction (la moins forte)
  • La force électrique (la plus forte)
38
Q

Quelles sont les deux facteurs qui influence la taille des pores des gels en électrophorèse?

A
  1. La concentration en monomère (ex: acrylamide)
  2. La quantité d’agent réticulant
39
Q

Autour de quel pH est généralement le tampon dans une électrophorèse?
Pourquoi?

A

Généralement autour de 9
Pour que les protéines aient au moins une charge négative.

40
Q

Vers quelle électrode les protéines migrent-elles et quelle “symbole électrique” possède l’électrode?

A

l’anode qui possède un symbole positive.

41
Q

Quels gels différents retrouve-t-on dans une électrophorèse? Quelles sont leur caractéristiques?

A
  1. Running gel / gel de séparation : C’est le gel principale qui possède les caractéristiques voulu pour la séparation. (réservoir du bas)
  2. Stacking gel / gel de concentration : plus haute porosité et pH ≈2 de moins (plus acide) que celui du Running gel (réservoir haut)
42
Q

Qu’est-ce que l’on utilise pour dénaturer les protéines en électrophorèse SDS-PAGE?

A

Le détergeant SDS qui déplie et allonge la protéine.

Ce détergeant porte une charge fortement négative, ce qui crée un rapport parfait charge/masse peu importe quelle est la protéine

43
Q

Quelle température est idéale pour travailler avec des protéines?

A

5ºC

44
Q

Pouvons-nous vortexer des solutions contenant des protéines?

A

Non, car la surface air-eau risque de dénaturer les protéines.

45
Q

Si la solution a un pH > pI, quelle est la charge nette de la protéine?
(pH=7 > pI=3)

A

La protéine a une charge nette négative.

46
Q

Si la solution est un un pH < pI, quelle est la charge nette de la protéine?
(pH=3 < pI=7)

A

La protéine a une charge nette positive.

47
Q

Quelles sont les 4 différences entre une électrophorèse SDS-PAGE et PAGE?

A
    • PAGE: faible résolution
      - SDS-PAGE: excellente résolution
    • PAGE: migration se base sur ratio charge/masse
      - SDS-PAGE: migration se base sur le logarithme de la masse molécule des protéine (1SDS/2AA=charge de -1)
    • PAGE: Dénaturation des complexes –> non
      - SDS-PAGE: Dénaturation des complexes –> oui
    • PAGE: Dénaturation des agrégats –> non
      - SDS-PAGE: Dénaturation des agrégats –> oui
48
Q

Que veut dire PAGE?

A

PolyacrylAmine Gel Electrophoresis

49
Q

Dans une électrophorèse est-ce les plus grosse ou les plus petites molécules qui se déplacent le plus vite?

A

Les plus petites se déplacent plus vite.

50
Q

Quelle unité est utilisé en électrophorèse?

A

Kilo Daltons

51
Q

Est-ce le SDS-PAGE ou le PAGE qui utilise un poids moléculaire?

A

La SDS-PAGE, car la fonction de charges par rapport à la masse est déjà connu grâce au SDS.

52
Q

Combien d’acide aminé sont recouvert par une molécule de détergent SDS?

A

2

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