9 Western Blot (presentación) Flashcards
¿Pasos generales para hacer un Western Blot? (5)
1-Preparación de muestras 2-Electroforesis para separa prots 3-Transferencia gel-membrana 4-Bloqueo de la membrana 5-Tinción y detección fluorescente de prots
¿Qué se usa para preparar las muestras de proteínas para electroforesis?
Se usa el SDS para desnaturalizar y darle una carga negativa a la muestra
¿Para qué sirve la electroforesis antes del Western Blot?
Separa las proteínas de acuerdo a su tamaño
¿Por qué hay qué transferir la información del gel a una membrana?
Porque al gel no se le puede aplicar ab
¿Qué es el Western Blot?
Técnica que permite la detección de proteínas específicas en una muestra
¿Por qué se bloquea la membrana en Western Blot?
Para que no se peguen los ab en lugares vacíos de la membrana;se evita un bloqueo no específico
¿Qué se usa para bloquear la membrana en Western Blot?
Se usa leche en polvo diluida
En la práctica, ¿Qué detecta el anticuerpo primario?
Detecta a al proteína específica
En la práctica, ¿qué detecta el segundo anticuerpo? ¿qué tiene de especial?
Detecta al anticuerpo primario
Está marcado con fosfatasa alcalina
¿Qué se hace en la transferencia? Mencione el nombre de la técnica
Se coloca gel junto a la membrana de nylon para que todas las proteínas se transfieran: técnica del sánduche
Describa el sánduche de la Técnica del sánduche
En una cámara de transferencia se pone: Papeles filtro Membrana Gel de poliacrilamida Papeles filtro
Pasos de para la transferencia a la membrana
Se hace el sánduche y se somete a un buffer (que permita que pase electricidad)
Se pone un polo negativo hacia el lado del gel y un polo positivo hacia el lado de la membrana; así las prots positivas quedan capturadas en la membrana
¿Cómo se hace el bloqueo de la membrana?
Se expone la membrana a leche en polvo, así se pegan las proteínas de la leche mientras se agita por una hora :o
Después de que se EXPONE la membrana a la leche, ¿qué se hace?
Se hace un lavado de la membrana
¿Qué se usa para detectar proteínas?
Se detectan con anticuerpos marcados con enzimas (como fosfatasa alcalina)
