5 Transformación de Bacterias Flashcards
¿Qué son los plásmidos?
Moléculas de ADN extracromosómico circular y de doble cadena
¿Los plásmidos forman parte del cromosoma bacteriano?
No, son moléculas aparte del cromosoma bacteriano
¿El ADN plasmídico está relacionado en la transcripción del ADN nuclear?
No, un plásmido se transcribe y se replica de manera independiente al ADN nuclear
¿Qué significa que un plásmido pueda ser de bajo número o alto número de copia?
Que pueden haber pocos o varios plásmidos del mismo tipo en cada célula
¿Las bacterias tienen plásmidos naturalmente y para qué les servirían?
Sí, muchos de estos contienen genes que les otorgan resistencia a antibióticos y/o que codifican para factores de virulencia, como toxinas
¿Para qué se usan los plásmidos en la creación de ADN recombinante?
Se generan plásmidos que contienen sitios de restricción para diferentes enzimas (sitio de clonación múltiple)
¿Cómo se forma un plásmido recombinante?
1-Se corta el ADN con enzimas de restricción que poseen las secuencias de corte en el sitio de clonación múltiple de del plásmido
2-El ADN se puede insertar dentro del plásmido
Proceso de transformación (en el contexto con bacterias)
A través de este proceso, se introduce un plásmido en una bacteria (generando bacterias modificadas que contiene ADN de otra fuente)
¿El ADN de los plásmidos irrumpe con la expresión de genes bacterianos?
No, el ADN exógeno puede expresarse en una bacteria, a la vez que se expresan otros genes bacterianos
¿Para qué sirve expresar ADN exógeno en una bacteria?
Puede servir para estudiar las propiedades de ese ADN o para obtener el producto de su expresión que puede ser una proteína específicaq
Uso de los plásmidos para hacer ¿librerías genómicas?
Yes
¿Las bacterias se transfieren plásmidos? ¿Esto les sirve?
Sí, pueden transferirse plásmidos y esto les puede dar nuevas características que les ayuden a adaptarse a nuevos ambientes
3 mecanismos de las bacterias para adquirir o intercambiar información genética
Transformación
Transducción
Conjugación bacteriana
Transformación bacteriana
Proceso mediante el cual una célula bacteriana capta e incorpora un fragmento de ADN exógeno que puede integrarse o no en su genoma
¿El proceso de la transformación es para todas las bacterias?
Se considera un proceso fisiológico para las bacterias que son naturalmente COMPETENTES
¿Cuándo se considera que una bacteria es competente?
Cuando tiene la capacidad para captar un fragmento de ADN exógeno
¿Todas las bacterias son competentes?
Aprox un 1% de todas las especies bacterianas son competentes de forma natural
¿Una bacteria no competente puede hacerse competente?
Sí, se puede inducir el estado de “bacteria competente” de de forma artificial en el laboratorio
Para inducir a una bacteria a ser competente se emplean:
Tratamientos químicos, físicos y enzimáticos que hacen que la célula bacteriana sea permeable al ADN exógeno (plásmido)
Dos métodos más importantes para inducir la transformación:
Shock térmico
Electroporación
Shock térmico
¿Cómo se hace?
Las células bacterianas son incubadas en hielo en presencia de cationes divalentes (Ca2+)
Luego, las células son sometidas a un breve shock térmico (42° por 30-120seg), lo cual permite que el ADN ingrese a las células
¿Por qué se incuba a las células bacterianas en hielo con cationes divalentes?
Porque esto permite la atracción del ADN exógeno a la membrana plasmática
¿Para qué sirve el shock térmico?
Es ideal para la introducción de plásmidos circulares
Electroporación
¿Qué se hace?
Las células bacterianas son sometidas a un pulso eléctrico que genera poros en la membrana celular, a través de los cuales pasan las moléculas de ADN extracelular
¿Cómo se utiliza la transformación bacteriana?
Sirve como herramienta en la creación de bacterias transgénicas con usos comerciales o que se pueden emplear como fuente de almacenamiento de las bibliotecas genómicas
Escherichia coli DH10B
¿Qué es?
Cepa bacteriana de laboratorio que posee una mutaciones en el gen lacZ del operón de la lactosa y hay una mutación en la enzima L-ribulosa-fosfato-4-epimerasa
En Escherichia coli DH10B hay una mutación en el gen lacZ del operón de la lactosa ¿Qué provoca esto?
No produce el péptido alpha que es parte de la beta-galactosidasa, por eso es incapaz de metabolizar la lactosa
En Escherichia coli DH10B hay una mutación en la enzima L-ribulosa-fosfato-4-epimerasa
¿Qué provoca esto?
Bloquea el metabolismo de la arabinosa
¿Cómo se seleccionan las Escherichia coli DH10B
transformadas exitosamente?
Esta cepa es sensible a diferentes antibióticos, entre ellos a la ampicilina
Esto permite seleccionar a las bacterias transformadas
¿Qué es el medio LB?
Es un medio de cultivo selectivo diseñado para el crecimiento de bacterias de la familia Enterobacteriaceae, las cuales son Gram Negativas
Si se incluye arabinosa en el medio LB, ¿qué pasa?
La arabinosa
es un azúcar simple que al ser degradado permite la transcripción del gen reportero rfp y esto producirá colonias de color rosado o rojo (Arab+)
Si no se añade arabinosa en el medio LB, ¿qué pasa?
En caso de que no haya
arabinosa en el medio, las colonias tendrán una coloración blanca.
