8 Electroforesis De Proteínas (presentación)

Question 1

¿Para qué sirve la técnica SDS-PAGE?

Answer 1

Técnica para separa proteínas de acuerdo a su tamaño

Question 2

Diferencias entre electroforesis de prots y de DNA (6)

Answer 2

• Tratamiento previo de las moléculas sólo se hace con prots
• Con prots el gel se pone verticalmente
• El ladder de DNA se mide en bp y en prots se mide en kdaltons
• Gel de PAGE necesita TEMED y persulfato de NH4; el gel de agarosa sólo baja la T°
• Buffer de carga con DNA es blue juice; el de prots tiene SDS, b-mercaptoetanol y azul de bromofenol
• Técnicas para observar las bandas son distintas

Question 3

¿Qué es el SDS?

Answer 3

Detergente para tratar las proteínas

Question 4

¿Qué es PAGE?

Answer 4

Electroforesis en gel de poliacrilamida para separa prots de acuerdo a su peso molecular

Question 5

¿Por qué sirve usar gel de poliacrilamida en la electroforesis de proteínas?

Answer 5

La poliacrilamida forma una red con poros más pequeños que la agarosa; por eso la resolución es mayor, así permite separar fragmentos que tengan diferencias muy pequeñas

Question 6

¿Cuál es la diferencia entre la agarosa y la acrilamida?

Answer 6

La agarosa viene de algas y se usa en electrofor de DNA

La acrilamida es un compuesto químico que no viene de algas y se usa en electrofor de prots

Question 7

¿Cuáles son las 4 estructuras de las proteínas?

Answer 7

Primaria: cadena lineal de aa
Secundaria: hélices alfa y hojas plegadas beta
Terciaria: estructura tridimensional gracias a puentes disulfuro
Cuaternaria: unión de varias cadenas

Question 8

¿Cómo se desnaturaliza una prot?

Answer 8

Se rompen los puentes disulfuro con b-mercaptoetanol

Question 9

¿Qué es y qué hace el SDS?

Answer 9

El dodecil sulfato sódico es un detergente que desnaturaliza la prot y le da cargas negativas uniformemente

Question 10

¿Cómo se mueven las muestras de prots tratadas con SDS en la electroforesis?

Answer 10

Igual que con el DNA: van hacia el polo positivo, las más pequeñas llegan más lejos

Question 11

¿En qué disposición se pone el gel de SDS-Page?

Answer 11

Se ponen verticalmente entre dos vidrios

Question 12

¿En qué se mide el ladder de una electroforesis de prots?

Answer 12

En kilo daltons (Kda)

Question 13

¿Qué forman la acrilamida y bis-acrilamida?

Answer 13

Son los compuestos que forman el gel poroso

Question 14

¿Cómo solidifica un gel de crilamida y bis-acrilamida?

Answer 14

Se necesita una reacción química y para eso se necesita TEMED y persulfato de amonio

Question 15

¿Qué hacen el TEMED y persulfato de amonio en la polimerización del gel?

Answer 15

TEMED es el catalizador y persulfato de amonio es el iniciador de la reacción; apenas se añaden empieza a polimerizar

Question 16

¿Es fácil hacer un gel de acrilamida?

Answer 16

No, muchas cosas que pueden salir mal; se puede polimerizar mal, quedar burbujas, o se pega el gel a uno de los vidrios. Por eso se compran geles ya hechos jeje.

Question 17

Para cargar un gel de acrilamida se usa:

Answer 17

Azul de bromofenol, que da color y densidad

SDS y beta-mercaptoetanol para que se sigan desnaturalizando las prots que se van a cargar

Question 18

¿Qué hace el azul de Coomassie?

Answer 18

Tiñe las proteínas

Question 19

¿Qué indican las bandas en el PAGE?

Answer 19

Cada banda corresponde a una prot distinta

Question 20

¿PAGE permite observar sólo una prot en específico?

Answer 20

Nel, muestra un perfil proteico de una muestra. Para ver una sola prot se usa Western Blot.

Question 21

¿Cómo es la molécula de SDS?

Answer 21

Es una molécula anfipática; tiene una cola hidrofóbica y una cabeza hidrofílica con carga negativa

Question 22

¿Cómo interactúa el SDS con el agua?

Answer 22

Forma “micelles” o micela, que son termodinámicamente favorables; las cabezas se agrupan con las colas hacia el centro

Question 23

¿Cómo se ordenan las proteínas en el gel por la masa y no por carga o volumen?

Answer 23

SDS unfolds the protein, se une y cancela las cargas netas positivas
1 SDS se una 2 aa, entonces la carga neta negativa es proporcional al # de aa (y por lo tanto la masa molecular)

Question 24

¿Cómo se diferencian las técnicas para observar las bandas en la electro for de prots y DNA?

Answer 24

Con DNA se utiliza SYBR safe para que se intercale en e DNA y con luz UV se puede ver el color
Con prots, se pueden hacer varias cosas: teñir con Azul de Coomassie , hacer western blot, o hacer espectrometría de masas

Question 25

¿Cómo quedaría, en teoría, una célula inmune al VIH?

Answer 25

Se elimina uno de los receptores del virus: CD4 y CCR5

Question 26

Para hacer una electroforesis de macrófagos editados para perder el receptor CCR5, ¿Cuáles son los controles positivos y negativos?

Answer 26

Positivo: macrófagos in editar
Negativo: células del páncreas (porque no tienen CCR5)

Question 27

¿Sólo con SDS-PAGE se sabe si se expresa CCR5?

Answer 27

Nel, para eso se hace un Western Blot