8 Electroforesis De Proteínas (presentación) Flashcards
¿Para qué sirve la técnica SDS-PAGE?
Técnica para separa proteínas de acuerdo a su tamaño
Diferencias entre electroforesis de prots y de DNA (6)
- Tratamiento previo de las moléculas sólo se hace con prots
- Con prots el gel se pone verticalmente
- El ladder de DNA se mide en bp y en prots se mide en kdaltons
- Gel de PAGE necesita TEMED y persulfato de NH4; el gel de agarosa sólo baja la T°
- Buffer de carga con DNA es blue juice; el de prots tiene SDS, b-mercaptoetanol y azul de bromofenol
- Técnicas para observar las bandas son distintas
¿Qué es el SDS?
Detergente para tratar las proteínas
¿Qué es PAGE?
Electroforesis en gel de poliacrilamida para separa prots de acuerdo a su peso molecular
¿Por qué sirve usar gel de poliacrilamida en la electroforesis de proteínas?
La poliacrilamida forma una red con poros más pequeños que la agarosa; por eso la resolución es mayor, así permite separar fragmentos que tengan diferencias muy pequeñas
¿Cuál es la diferencia entre la agarosa y la acrilamida?
La agarosa viene de algas y se usa en electrofor de DNA
La acrilamida es un compuesto químico que no viene de algas y se usa en electrofor de prots
¿Cuáles son las 4 estructuras de las proteínas?
Primaria: cadena lineal de aa
Secundaria: hélices alfa y hojas plegadas beta
Terciaria: estructura tridimensional gracias a puentes disulfuro
Cuaternaria: unión de varias cadenas
¿Cómo se desnaturaliza una prot?
Se rompen los puentes disulfuro con b-mercaptoetanol
¿Qué es y qué hace el SDS?
El dodecil sulfato sódico es un detergente que desnaturaliza la prot y le da cargas negativas uniformemente
¿Cómo se mueven las muestras de prots tratadas con SDS en la electroforesis?
Igual que con el DNA: van hacia el polo positivo, las más pequeñas llegan más lejos
¿En qué disposición se pone el gel de SDS-Page?
Se ponen verticalmente entre dos vidrios
¿En qué se mide el ladder de una electroforesis de prots?
En kilo daltons (Kda)
¿Qué forman la acrilamida y bis-acrilamida?
Son los compuestos que forman el gel poroso
¿Cómo solidifica un gel de crilamida y bis-acrilamida?
Se necesita una reacción química y para eso se necesita TEMED y persulfato de amonio
¿Qué hacen el TEMED y persulfato de amonio en la polimerización del gel?
TEMED es el catalizador y persulfato de amonio es el iniciador de la reacción; apenas se añaden empieza a polimerizar
¿Es fácil hacer un gel de acrilamida?
No, muchas cosas que pueden salir mal; se puede polimerizar mal, quedar burbujas, o se pega el gel a uno de los vidrios. Por eso se compran geles ya hechos jeje.
Para cargar un gel de acrilamida se usa:
Azul de bromofenol, que da color y densidad
SDS y beta-mercaptoetanol para que se sigan desnaturalizando las prots que se van a cargar
¿Qué hace el azul de Coomassie?
Tiñe las proteínas
¿Qué indican las bandas en el PAGE?
Cada banda corresponde a una prot distinta
¿PAGE permite observar sólo una prot en específico?
Nel, muestra un perfil proteico de una muestra. Para ver una sola prot se usa Western Blot.
¿Cómo es la molécula de SDS?
Es una molécula anfipática; tiene una cola hidrofóbica y una cabeza hidrofílica con carga negativa
¿Cómo interactúa el SDS con el agua?
Forma “micelles” o micela, que son termodinámicamente favorables; las cabezas se agrupan con las colas hacia el centro
¿Cómo se ordenan las proteínas en el gel por la masa y no por carga o volumen?
SDS unfolds the protein, se une y cancela las cargas netas positivas
1 SDS se una 2 aa, entonces la carga neta negativa es proporcional al # de aa (y por lo tanto la masa molecular)
¿Cómo se diferencian las técnicas para observar las bandas en la electro for de prots y DNA?
Con DNA se utiliza SYBR safe para que se intercale en e DNA y con luz UV se puede ver el color
Con prots, se pueden hacer varias cosas: teñir con Azul de Coomassie , hacer western blot, o hacer espectrometría de masas
