7 Dot Blot (Presentación) Flashcards
¿En qué se basa el Dot Blot?
En la hibridación del DNA
3 cosas que se necesita para el Dot Blot
1-Muestra DNA desnaturalizada
2-Sonda marcada que reconoce una secuencia esp
3-Membrana de nylon que fija el DNA
¿Para qué sirve la membrana de Nylon?
Para pegar ADN
Creación de la sonda de DNA
1-Se hace un PCR del gen (gen de la B-actina) para tener un molde
2-Los primers randómicos se pegan a cualquier parte del molde
3-La polimerasa de Klenow genera fragmentos 5’3’ y se generan fragmentos de distintos tamaños complementarios a la cadena molde, marcados con Biotina
Herramientas para hacer la sonda (3)
Klenow Polimerasa
Primers randómicos
dNTPs: A, T, G, y C marcada con biotina
¿Cómo se desnaturaliza las muestras de DNA?
Se ponen las diferentes muestras de DNA en tubitos diferentes y se calienta a 100°
Se añaden compuestos como EDTA para conservar la cadena a temperaturas altas
Luego se ponían en hielo para que no se vuelvan a mezclar
¿Qué se hace en la fijación de la membrana?
Se pega el DNA desnaturalizado de los distintos organismos
Se hacen los círculos para cargar el DNA y las sondas
Control positivo y negativo de la práctica (Buscar el gen de la B-actina en DNA de humano, insecto y bacteria)
Control positivo: la sonda porque siempre va a cambiar de color
Control negativo: insecto y bacteria porque ahí no está el gen; no son complementarios a nada
¿Cómo se pega el DNA en la membrana de Nylon?
Con rayos ultravioleta; el DNA se queda desnaturalizado
¿Para qué sirve el bloqueo de la membrana?
Se usa DNA de esperma de salmón para llenar todos los espacios de la membrana para que la sonda no se peque a otras partes de la membrana de nylon
¿Qué se hace en la incubación de la sonda?
La sonda se pega donde está el gen de la B-actina en las muestras humanas
¿Para qué sirve el lavado de la membrana?
Se retiran los exceso de cosas en la membrana; se limpia la membrana del esperma de salmón, excesos de sondas que no se unieron, y otros compuestos.
¿Cómo se hace la unión del conjugado con a sonda marcada?
Se sumerge la membrana a un conjugado (solución streptavidina+fosfatasa alcalina)
La streptavidina tiene afinidad por la biotina y se unen
¿Cuándo se realiza un lavado?
Cada vez que se expone la membrana a algo (después del conjugado por ejemplo)
¿Cómo se hace el revelado de la membrana?
Se expone a la membrana a la solución reveladora aque tiene NBT y BCIP
¿Cómo ocurre el revelado de la membrana?
Se agrega BCIP y NBT; ocurren dos reacciones: una de dimerización y otra de óxido reducción
¿Cómo se obtiene el revelado?
Se pone la solución reveladora en la oscuridad
¿Las diferencias de color en el revelado qué indican?
El cambio de color indica la presencia del gen; no importa la intensidad del color, si hay cambio, así sea leve, está el gen
¿Las diferencias en la intensidad de color por qué se dan?
Porque las sondas pueden estar menos marcadas que otras; la intensidad de color depende de muchos factores
Pasos que se incluyen en el Southern Blot (a diferencia del Dot Blot)
Digestión de DNA y traspaso de gel de agarosa a una membrana
Microarregleos de DNA (Microarrays)
¿Para qué sirven?
Sirven para detectar más de una secuencia en una muestra; hay distintos genes en un mismo pocillo
Aplicaciones del Dot Blot
- Predicción de enfermedades congénitas
- Identificación de especies
- Farmacogenómica
