8- Technologies de l'ADN COPY Flashcards
Que sont les enzymes de restriction
Enzymes de restriction = endonucléase de restriction.
Endonucléases coupant l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences de nucléotides spécifiques dites sites de restriction. La vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques.
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides.
Une exonucléase est une enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’ -> 3’ ou dans le sens 3’->5’.
Une endonucléase est une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique produisant des fragments.
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction?
Les enzymes de restriction servent à la défense contre les virus des bactéries (bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux.
Que peut former la coupure par des enzymes de restriction?
Bouts collants (le lien phosphodiester coupé n’est pas au milieu du site de restriction) ou francs.
Comment peut-on séparer et identifier les fragments d’ADN coupés après la digestion avec des enzymes de restriction?
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel d’Agarose.
Comment migre l’ADN suite à l’application du champ électrique dans le gel d’Agarose?
(1) Vers le pôle +, car l’ADN est -
(2) Plus petit ira plus vite, donc + loin
Comment se fait la détection des fragments d’ADN dans un gel?
Bromure d’éthidium (un agent intercalant (cancérigène)) qui est une molécule fluorescente s’intercalant dans la double hélice, et rayons UV.
OU
ADN marqué radioactivement.
Comment joindre les bout coupés par une enzyme de restriction
Ligase.
Qu’est-ce que la ligation
Ligation : joindre 2 bouts d’ADN .
Création d’ADN recombinant au labo en rejoignant n’importe quels fragments d’ADN avec une ligase.
Marche pour les bouts collants et francs (efficacité 100x plus faible que les bouts collants).
C’est logique que l’efficacité des bouts francs soient moindre que celle des bouts collants, car les bouts collants s’apparient, ce qui stabilise les interaction.
Qu’est-ce que le cloning?
Ligation d’un fragment d’ADN dans un vecteur d’ADN comme un plasmide.
L’objectif du cloning étant de perpétuer et produire l’ADN recombinant en quantité illimitées.
C’est quoi un plasmide?
PLASMIDE :
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de manière autonome dans un organisme hôte.
Il a une origine de réplication fonctionnelle et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication.
Que contient le plasmide utilisé comme vecteur?
Le plasmide est un vecteur, qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN :
Plasmide contenant des séquences d’ADN requises pour :
- La réplication des bactéries (Origine de réplication).
- Gène de sélection (résistance à des antibios) pour sélectionner spécifiquement les bactéries contenant le vecteur.
- Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN.
- Dans les versions plus tardives, on retrouve un site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN).
Qu’est-ce qu’une transformation?
Insérer un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure.
Efficacité de 1/2000, sélectionne cellules ayant le plasmide grâce à l’antibio. (vraiment pas toutes les ¢ vont recevoir le plasmide).
Donc, on utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que des gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline, pour sélectionner les ¢ (les clones) qui ont reçu le plasmide.
Quelles sont les utilisations possibles de l’ADN amplifié?
- Préparer une grande qté d’insert (ADN inséré) afin de le séquencer.
- Poursuivre un autre clonage avec ce plasmide.
- Production de protéines recombinantes (insuline humaine, GH humaine), facteurs de coagulation, immunogènes pour vaccins, lactase, etc.
Qu’est-ce que GFP
GFP : Green Fluorescent Protein.
Protéine flurorescente de méduse.
Fusions de gènes avec GFP permettent d’étudier in vivo:
- Niveaux de transcription des gènes.
- Niveaux de traduction.
- Localisation cellulaire de protéines.
- Co-localisation cellulaire.
Que permettent les protéines fluorescentes de différentes couleurs?
Co-localisation de protéines et de structures cellulaires.
De quoi provient la matrice pour l’ARN pol in vitro?
ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique.
Que se passe-t’il à l’ADN avec la hausse de la température ou du pH?
Passe de double à simple brin et l’absorbance monte.
Même effet observé avec hausse de pH.
Point d”inflexion=Tm (pour «melting temperature»).
Figure ci-dessous montre la courbe de «dénaturation» de l’ADN face à l’augmentation de la température.
Que se passe-t’il pour la dénaturation d’un ADN poly A-T vs G-C
Poly G-C a besoin de plus d’énergie, car 3 ponts-H au lieu de 2, donc T plus haute requise.
ADN WT entre les 2.
Qu’est-ce que l’hybridation?
L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (hybridation, dans ce cas re-hybridation) en ADN double brin lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales).
Quelle est la méthode de terminaison de chaîne (de Sanger)?
Aussi appelée didéoxy.
C’est un moyen pour détecter une mutation dans un gène par exemple.
Résumé : On ajoute quelques didéoxyribonucléotides (ddNTP) qui ont un H au lieu de OH au bout 3’, ce qui arrête la réaction de polymérisation.
1) Séparation des brins et ajout d’amorce.
2) Ajout des amorces des désoxynucléotides (dG, dA, dT, et dC), un des dNTP est marqué pour détection. Ajout d’un des didéoxynucléotides (ddNTP) par tube et ADN polymérase.
3) Séparation sur gel des fragments et détection des brins synthétisés par extension de l’amorce.
4) Lecture de la séquence sur gel.
C’EST UNE MÉTHODE POUR DÉTERMINER LA SÉQUENCE EXACTE D’UN BRIN D’ADN.
Comment est l’amorce dans la méthode du didéoxy?
15 à 30 nucléotides, c’est un oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice. L’amorce est radioactive ou fluorescente. La polymérase permet ajoutdes dNTP et polymérise en 3’ de l’amorce.
Comment se fait un cycle de PCR (polymerase chain reaction)?
Cycle PCR :
1) Séparation des brins (95°).
2) Hybridation des amorces (55°). (ON FAIT JUSTE LES COLLER AUX BRINS SIMPLES ET APRÈS ON FAIT DE LA POLYMÉRASE).
3) Synthèse par la Taq1 ADN polymérase (72°).
Taq polymérase est extraite d’une bactérie thermophile.
En gros, c’est une amplification.
Comment se fait l’amplification par PCR
20-30 cycles de 5 minutes.
Note : + les amorces sont longues, + elles seront spécifiques (moins de chances de reconnaître plus d’un endroit dans le génome).
Quelle est l’utilisation du PCR en médecine légale?
Pour la détermination de la paternité.
STR et VNTR
Copies d’ADN du père et de la mère sont analysées. Si les deux copies du VNTR/STR n’ont pas le même nombre de séquences répétées on voit deux bandes après le gel d’électrophorèse.
Plus le STR ou VNTR testé est polymorphique (nombre de séquences répétées très variable selon les individus), plus il est utile dans ce test de profil génétique.
Permet de déterminer qui est le vrai père ou la vraie mère p/e.
C’est justement grâce aux nombreux polymorphismes que chaque personne a un ADN pouvant être distingué de l’ADN des autres individus.
