8- Technologies de l'ADN Flashcards
Que sont les enzymes de restriction
Enzymes de restriction = endonucléase de restriction.
Endonucléases coupant l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences de nucléotides spécifiques dites sites de restriction. La vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques.
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides.
Une exonucléase est une enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’ -> 3’ ou dans le sens 3’->5’.
Une endonucléase est une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique produisant des fragments.
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction?
Les enzymes de restriction servent à la défense contre les virus des bactéries (bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux.
Que peut former la coupure par des enzymes de restriction?
Bouts collants (le lien phosphodiester coupé n’est pas au milieu du site de restriction) ou francs.
Comment peut-on séparer et identifier les fragments d’ADN coupés après la digestion avec des enzymes de restriction?
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel d’Agarose.
Comment migre l’ADN suite à l’application du champ électrique dans le gel d’Agarose?
(1) Vers le pôle +, car l’ADN est -
(2) Plus petit ira plus vite, donc + loin
Comment se fait la détection des fragments d’ADN dans un gel?
Bromure d’éthidium (un agent intercalant (cancérigène)) qui est une molécule fluorescente s’intercalant dans la double hélice, et rayons UV.
OU
ADN marqué radioactivement.
Comment joindre les bout coupés par une enzyme de restriction
Ligase.
Qu’est-ce que la ligation
Ligation : joindre 2 bouts d’ADN .
Création d’ADN recombinant au labo en rejoignant n’importe quels fragments d’ADN avec une ligase.
Marche pour les bouts collants et francs (efficacité 100x plus faible que les bouts collants).
C’est logique que l’efficacité des bouts francs soient moindre que celle des bouts collants, car les bouts collants s’apparient, ce qui stabilise les interaction.
Qu’est-ce que le cloning?
Ligation d’un fragment d’ADN dans un vecteur d’ADN comme un plasmide.
L’objectif du cloning étant de perpétuer et produire l’ADN recombinant en quantité illimitées.
C’est quoi un plasmide?
PLASMIDE :
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de manière autonome dans un organisme hôte.
Il a une origine de réplication fonctionnelle et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication.
Que contient le plasmide utilisé comme vecteur?
Le plasmide est un vecteur, qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN :
Plasmide contenant des séquences d’ADN requises pour :
- La réplication des bactéries (Origine de réplication).
- Gène de sélection (résistance à des antibios) pour sélectionner spécifiquement les bactéries contenant le vecteur.
- Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN.
- Dans les versions plus tardives, on retrouve un site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN).
Qu’est-ce qu’une transformation?
Insérer un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure.
Efficacité de 1/2000, sélectionne cellules ayant le plasmide grâce à l’antibio. (vraiment pas toutes les ¢ vont recevoir le plasmide).
Donc, on utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que des gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline, pour sélectionner les ¢ (les clones) qui ont reçu le plasmide.
Quelles sont les utilisations possibles de l’ADN amplifié?
- Préparer une grande qté d’insert (ADN inséré) afin de le séquencer.
- Poursuivre un autre clonage avec ce plasmide.
- Production de protéines recombinantes (insuline humaine, GH humaine), facteurs de coagulation, immunogènes pour vaccins, lactase, etc.
Qu’est-ce que GFP
GFP : Green Fluorescent Protein.
Protéine flurorescente de méduse.
Fusions de gènes avec GFP permettent d’étudier in vivo:
- Niveaux de transcription des gènes.
- Niveaux de traduction.
- Localisation cellulaire de protéines.
- Co-localisation cellulaire.
Que permettent les protéines fluorescentes de différentes couleurs?
Co-localisation de protéines et de structures cellulaires.