VO.3 Laboratorium technieken Flashcards
Wat is te zien in de tumorvorming?
Het verloopt stapsgewijs waarbij steeds nieuwe afwijkingen ontstaan onder andere in celgroei regulerende genen
- Directe groei-activerende genen (oncogenen)
- Bevorderen de groei door het wegvallen van groei remmende invloeden (tumorsupressorgenen)
Waar vinden constant afwijkingen plaats in de tumorvorming?
In het DNA waardoor genen niet meer of afwijkend functioneren
Wat kunnen moleculair genetische lab technieken bijdragen?
- Beeld van het mechanisme van ongeremde groei
- Gedetailleerdere diagnostiek
- nieuwe therapeutische mogelijkheden
Wat is een veel voorkomende afwijking bij CML?
BCR-ABL gen
Waardoor het Philadelphia chromosoom abnormaal klein is = chr 22
Chromosoom 9 wordt langer en 22 wordt kleiner
9+ en 22- –> BCR-ABL ligt op 22
Hoe kan worden aangetoond hoe de translocatie heeft plaatsgevonden?
Met een FISH van CML metafasen (!!!!)
probe voor ABL, 5’-BCR en 3’-BCR
Hoe vindt de t(9;22) plaats?
Een deel van het chr 9 met het (volledige) ABL-gen is verplaats naar chr 22, vast aan 5’-BCR
Het chromosoom van 22 met 3’-BCR is naar chr 9 gegaan
Waaruit bestaat het fusiegen bij CML?
ABL-gen en 5’-BCR
Op welke fase kan de FISH voor het Philadelphia chromosoom uitgevoerd worden?
- Metafase
- Interfase
Wat zie je naast de translocatie bij CML patienten?
Een normaal chr 9 en normaal chr 22 (normale BCR en ABL positie)
Hoe tonen we het BCR-gen aan met een FISH?
Probe voor 3’-BCR en eentje voor de 5’-BCR kant -> niet het hele gen, maar een gedeelte
Wat kunnen we aantonen met de 5’-BCR probe en de 3’-BCR probe?
De 5’-BCR probe wordt gebuikt om het fusie-gen aan te tonen
De 3’-BCR probe wordt gebuikt om het verplaatste stukje BCR op chr 9 aan te tonen
Hoe kunnen we bekijken of de mutaties consequenties hebben voor het mRNA?
RNA blot
Wat kunnen we zien op een RNA Blot?
De gevolgen van de mutatie
Wat is er te zien bij CML patienten op een RNA-blot?
Een dunne band die niet zichtbaar is bij gezonde mensen
De band ligt hoger dan de normale RNA-moleculen = groter = fusiegen van ABL en 5’-BCR
De patienten hebben ook nog 1 normaal chromosoom (normale kopie van gen op normale positie) –> band op zelfde plek is gezonde mensen, maar wel dunner omdat dit RNA-product minder dan normaal tot expressie wordt gebracht
Wat wordt aangetoond met de 3’-probe in het RNA Blot?
Kleiner RNA product dan normale RNA van BCR –> kleiner doordat het gen kleiner is dan het oorspronkelijke BCR-gen
Dit is het stuk 3’ sta van het oorspronkelijke BCR is afgesplitst en naar chr 9 is gegaan –> GEEN deel van fusie-gen
Hoe kunnen we het eiwit van BCR-ABL onderzoeken?
VIa anti-ABL en anti-BCR in een immunoblot
Wat laat het immunoblot zien bij een CML patient?
Zowel via de anti-BCR en de anti-ABL laten eenzelfde eiwit zien (= bewijs van fusie-gen) die veel groter is dan de normale eiwitten
Daarnaast is er ook een normaal ABL en een normaal BCR eiwit zichtbaar door de niet aangedane chromosomen –> verminderd aanwezig (door 1 chromosoom tot expressie gebracht ipv 2)W
Wat is belangrijk bij de diagnostiek?
De gevoeligheid van de detectiemethode is van cruciaal belang: hoeveel CML-tumorcellen kan met nog detecteren te midden van een overmaat aan normale cellen
Wat zijn de 5 mogelijkheden om de t(9;22) vast te stellen?
- Klassieke cytogenetica (chromosoom bandering)
- FISH met BCR/ABL probes op metafase chromosomen
- FISH met BCR/ABL probes op interfase kernen
- RNA-blotting met BCR-ABL probes
- Immunoblotting met anti-ABL en anti-BCR
Welke van de 5 mogelijkheden om de translocatie vast te stellen is het meest gevoelig? Waarom? Wat zie je?
FISH met BCR-ABL probes op interfase kernen
- In 1x naar heel veel cellen kijken
- Weinig genetische materiaal nodig
Groen en rood bolletje heel dicht bij elkaar
Wat is een nadeel aan de methode van FISH op interfase kernen?
Chromosomen liggen door elkaar heen –> kan per toeval het groene en rode bolletje bij elkaar komen te liggen –> heel zeldzaam
Hoe kan er onderscheid gemaakt worden tussen co-locatie of een fusiegen?
Als dit in 1 cel plaatsvindt is het zeer waarschijnlijk toeval
Als het een meerdere cellen zijn duidt dit op de specifieke translocatie
Waarom is een FISH in de metafase minder handig?
Omdat er procentueel maar weinig cellen in de metafase zitten
–> Zou kunnen zijn dat tumorcellen alleen in de interfase zitten waardoor missen
Als tumorcellen in de metafase zitten dan wel meteen zichtbaar
Welke methode is het allergevoeligst?
PCR methoden
