VO.3 Laboratorium technieken Flashcards
Wat is te zien in de tumorvorming?
Het verloopt stapsgewijs waarbij steeds nieuwe afwijkingen ontstaan onder andere in celgroei regulerende genen
- Directe groei-activerende genen (oncogenen)
- Bevorderen de groei door het wegvallen van groei remmende invloeden (tumorsupressorgenen)
Waar vinden constant afwijkingen plaats in de tumorvorming?
In het DNA waardoor genen niet meer of afwijkend functioneren
Wat kunnen moleculair genetische lab technieken bijdragen?
- Beeld van het mechanisme van ongeremde groei
- Gedetailleerdere diagnostiek
- nieuwe therapeutische mogelijkheden
Wat is een veel voorkomende afwijking bij CML?
BCR-ABL gen
Waardoor het Philadelphia chromosoom abnormaal klein is = chr 22
Chromosoom 9 wordt langer en 22 wordt kleiner
9+ en 22- –> BCR-ABL ligt op 22
Hoe kan worden aangetoond hoe de translocatie heeft plaatsgevonden?
Met een FISH van CML metafasen (!!!!)
probe voor ABL, 5’-BCR en 3’-BCR
Hoe vindt de t(9;22) plaats?
Een deel van het chr 9 met het (volledige) ABL-gen is verplaats naar chr 22, vast aan 5’-BCR
Het chromosoom van 22 met 3’-BCR is naar chr 9 gegaan
Waaruit bestaat het fusiegen bij CML?
ABL-gen en 5’-BCR
Op welke fase kan de FISH voor het Philadelphia chromosoom uitgevoerd worden?
- Metafase
- Interfase
Wat zie je naast de translocatie bij CML patienten?
Een normaal chr 9 en normaal chr 22 (normale BCR en ABL positie)
Hoe tonen we het BCR-gen aan met een FISH?
Probe voor 3’-BCR en eentje voor de 5’-BCR kant -> niet het hele gen, maar een gedeelte
Wat kunnen we aantonen met de 5’-BCR probe en de 3’-BCR probe?
De 5’-BCR probe wordt gebuikt om het fusie-gen aan te tonen
De 3’-BCR probe wordt gebuikt om het verplaatste stukje BCR op chr 9 aan te tonen
Hoe kunnen we bekijken of de mutaties consequenties hebben voor het mRNA?
RNA blot
Wat kunnen we zien op een RNA Blot?
De gevolgen van de mutatie
Wat is er te zien bij CML patienten op een RNA-blot?
Een dunne band die niet zichtbaar is bij gezonde mensen
De band ligt hoger dan de normale RNA-moleculen = groter = fusiegen van ABL en 5’-BCR
De patienten hebben ook nog 1 normaal chromosoom (normale kopie van gen op normale positie) –> band op zelfde plek is gezonde mensen, maar wel dunner omdat dit RNA-product minder dan normaal tot expressie wordt gebracht
Wat wordt aangetoond met de 3’-probe in het RNA Blot?
Kleiner RNA product dan normale RNA van BCR –> kleiner doordat het gen kleiner is dan het oorspronkelijke BCR-gen
Dit is het stuk 3’ sta van het oorspronkelijke BCR is afgesplitst en naar chr 9 is gegaan –> GEEN deel van fusie-gen
Hoe kunnen we het eiwit van BCR-ABL onderzoeken?
VIa anti-ABL en anti-BCR in een immunoblot
Wat laat het immunoblot zien bij een CML patient?
Zowel via de anti-BCR en de anti-ABL laten eenzelfde eiwit zien (= bewijs van fusie-gen) die veel groter is dan de normale eiwitten
Daarnaast is er ook een normaal ABL en een normaal BCR eiwit zichtbaar door de niet aangedane chromosomen –> verminderd aanwezig (door 1 chromosoom tot expressie gebracht ipv 2)W
Wat is belangrijk bij de diagnostiek?
De gevoeligheid van de detectiemethode is van cruciaal belang: hoeveel CML-tumorcellen kan met nog detecteren te midden van een overmaat aan normale cellen
Wat zijn de 5 mogelijkheden om de t(9;22) vast te stellen?
- Klassieke cytogenetica (chromosoom bandering)
- FISH met BCR/ABL probes op metafase chromosomen
- FISH met BCR/ABL probes op interfase kernen
- RNA-blotting met BCR-ABL probes
- Immunoblotting met anti-ABL en anti-BCR
Welke van de 5 mogelijkheden om de translocatie vast te stellen is het meest gevoelig? Waarom? Wat zie je?
FISH met BCR-ABL probes op interfase kernen
- In 1x naar heel veel cellen kijken
- Weinig genetische materiaal nodig
Groen en rood bolletje heel dicht bij elkaar
Wat is een nadeel aan de methode van FISH op interfase kernen?
Chromosomen liggen door elkaar heen –> kan per toeval het groene en rode bolletje bij elkaar komen te liggen –> heel zeldzaam
Hoe kan er onderscheid gemaakt worden tussen co-locatie of een fusiegen?
Als dit in 1 cel plaatsvindt is het zeer waarschijnlijk toeval
Als het een meerdere cellen zijn duidt dit op de specifieke translocatie
Waarom is een FISH in de metafase minder handig?
Omdat er procentueel maar weinig cellen in de metafase zitten
–> Zou kunnen zijn dat tumorcellen alleen in de interfase zitten waardoor missen
Als tumorcellen in de metafase zitten dan wel meteen zichtbaar
Welke methode is het allergevoeligst?
PCR methoden
Wat zijn de stappen van RT-PCR?
Reversed transcribed PCR
1. mRNA wordt geïsoleerd uit het beenmerg van een CML patient
2. cDNA wordt gemaakt mbv een T primer en reverse transcriptase
3. cDNA wordt onderworpen aan PCR met primers specifiek voor ABL- en BCR-gebieden
4. De DNA-fragmenten worden op gelelectroforese gescheiden en gekleurd op DNA
Welke primers worden gebruikt bij PCR voor de CML translocatie?
- Voorwaartse primer voor 5’-coderend gebied van BCR
- Terugwaartse primer voor 3’-coderend gebied van BCR
- Terugwaartse primer van een coderend gebied in ABL
Hoe kan men een gebied aantonen met PCR?
ALTIJD met twee primers: een voorwaartse en een terugwaartse primer
Wat zijn de mogelijkheden bij de PCR voor BCR en ABL met de juiste gegeven primers?
- Gezond: alleen BCR gen omdat een voorwaartse en terugwaartse primer voor dit gen
ABL niet omdat hier geen voorwaartse primer voor is - CML: BCR-gen en fusie-gen met de voorwaartse BCR primer en de terugwaartse ABL primer
Welke twee banden worden gevonden bij patienten met CML met PCR?
1 van het fusiegen met de voorwaartse 5’-BCR primer en de terugwaartse 3’-ABL primer
1 normaal gen met de voorwaartse 5’-BCR primer en de terugwaartse 3’-BCR primer
Wat is het verschil tussen de verschillende CML’s?
- Translocatie punten van chr 9 en 22 zijn bij alle patienten verschillend
Wat zijn de overeenkomsten tussen verschillende CML’s?
Met de RT-PCR zie je wel vrijwel altijd dezelfde band –> breekpunt van BCR-gen bijna altijd in een intron –> zal niet uitmaken voor het eiwitproduct (waar dan ook in het intron een breukpunt komt) –> we bekijken eigenlijk het cDNA dat is opgesteld uit het mRNA waar alle introns al zijn verwijderd
Soms is er een korter fusie-gen waarneembaar. Hoe vaak komt dit voor? Hoe ontstaat dit?
Minder vaak voorkomend
- BCR-gen kan breken bij twee (van de vier) introns
- hierdoor zullen er twee of drie EXONS naar chr 9 verhuizen
Wat is aannemelijk bij een korter fusie-gen?
Dat het breekpunt van het chromosoom bij de patient in het eerste intron lag waardoor er een groter stuk van het BCR-gen is verhuisd naar chr 9 en een kleiner deel van het 5’-BCR achterbleef bij chr 22 om het fusie-gen te vormen
5’-kant van het gen is de “beginkant”
Wat is een belangrijk enzym voor het herstel van dubbelstrengs DNA breuken via kruisverbindingen tussen strengen?
Via homologe recombinatie het recombinatie enzym RAD51 –> RAD51 foci hoopt zich op, op de plaats van de dubbelstrengs breuk
Een groeiende celkweek van huidfibroblasten wordt betraald met röntgenstraling en een paar uur Laer worden ze gefixeerd en gekleurd met anti-RAD51 antilichamen. Wat is er te zien?
In de kern zullen foci zichtbaar worden omdat het RAD51 zicht ophoopt bij het DNA met dubbelstrengsbreueken in de kern
Zullen bij alle soorten bestraalde cellen (röntgenstraling) RAD51 foci zichtbaar worden?
Nee omdat niet in alle cellen gelijk dubbelstrengs DNA breuken optreden en er dus niet overal RAD51 bij het DNA nodig is
Laten tumorcellen en normale cellen RAD51 foci zien na bestraling bij borstkanker?
Ja beiden
RAD51 is niet altijd zichtbaar. Waar heeft dit mee te maken?
Homologe recombinatie gebeurt alleen in delende cellen omdat de zusterchromatide nodig is –> alleen in de S-fase en de G2-fase zullen er RAD51 foci aanwezig zijn
RAD51 foci worden aangetoond in bepaalde cellen. Wat zegt dit over de fase waarin de cellen zitten?
Dat ze in de S-fase of de G2-fase zitten
In een tumor zijn nauwelijks RAD51 foci zichtbaar. Wat zijn twee mogelijke verklaringen hiervoor?
- Homologe recombinatie is niet meer mogelijk door BRCA deficiëntie
- Alle cellen bevinden zich in de G1- of M-fase waardoor geen homologe recombinatie
Hoe kunnen we bepalen of er in de tumorcellen waar geen RAD51 foci te zien zijn, sprake is van BRCA deficiëntie of dat de cellen in de G1 of M-fase zitten?
Tumorbiopten kleuren op cycline A
Met de kleuring kan bepaald worden in welke fasen de cel zich wel of niet kan bevinden
Want cycline A vaak in S-fase of G2-fase
Wat is kenmerkend aan cycline A?
Komt veel voor in cellen in de G2 of S-fase
Wat is er te zien als de HR werkt bij tumorcellen na bestraling en die aangekleurd zijn voor cycline A?
Cellen worden aangekleurd met cycline A en RAD51 foci
Wat is er te zien als de HR niet werkt bij tumorcellen na bestraling en die aangekleurd zijn voor cycline A? Wat betekent dit?
Geen RAD51 foci –> wat is reden hiervoor?
Wel cycline A kleuring dus zitten wel in de goede fase voor HR –> BRCA deficiëntie in tumor
Waarom is het belangrijk om in borstkanker patienten te screenen voor BRCA-deficientie?
Dit is van belang voor de Therapeutische mogelijkheden
Wat kan worden gebruikt bij BRCA-deficiente cellen?
PARP-remmer
Wat kan worden gebruikt bij BRCA-proficiente borstkanker?
PARP-remmer met hyperthermie
Door verwarming wordt het BRCA afgebroken/deficient
Wat kan er, naast een RAD51 bepaling, nog meer worden gedaan om een BRCA-deficientie aan te tonen?
NGS voor een mutatie
Wat is het verschil in het soort kweek tussen de RAD51 bepaling en de NGS?
Voor de RAD51 bepaling moeten de cellen in kweek en voor NGS kan ook het ingevroren materiaal gebruikt worden
NGS is veel duurder
