Toksologiske tests

Question 1

Hvad angiver ADI?

Answer 1

ADI (”Acceptable Daily Intake”) angiver den mængde af et stof, der kan indtages dagligt, uden nogen nævneværdig sundhedsrisiko, gennem et helt liv.

Question 2

Hvordan fastsættes ADI?

Answer 2

En ADI-værdi bestemmes ud fra toksikologiske langtidsundersøgelser med dyr. Først fastlægges NOAEL (”No Observed Adverse Effect Level”), dvs. et eksponeringsniveau som dyrene kan tåle som livslang belastning, uden at udvikle påviselige toksiske skader. Normalt udføres undersøgelserne med flere doser. I tilfælde af flere undersøgelser af forskellige effekter vælges normalt den laveste NOAEL.

Derefter divideres NOAEL (eller et andet udgangspunkt såsom benchmark dosisniveau/BMD) med en sikkerhedsfaktor (SF). Størrelsen af SF er valgt, for at tage højde for usikkerheder i ekstrapolering af data fra dyr til mennesker og individuel variation. Den mest almindelige SF er 100 (10-1000), hvori der tages højde for at mennesker kan være 10 gange mere følsomme overfor stoffet end forsøgsdyr og at en del af befolkningen kan være 10 gange mere følsomme end den gennemsnitlige variation, altså en individuel følsomhed.

Question 3

Hvad angives ADI værdier i?

Answer 3

mg (stof) pr. kg legemsvægt pr. dag

Question 4

Jo højere ADI des…

Answer 4

større mængder af en forbindelse kan indtages, uden at udgøre en sundhedsrisiko.

Question 5

Hvad angiver LD50?

Answer 5

Den dosis hvor halvdelene af dyrene dør.

Question 6

Hvad angiver NOAL?

Answer 6

“No adverse effekt level” = Den dosis hvor der ikke er en statistisk forskel til kontrollen.

Question 7

Hvad er formålet med fixed-dose procedure forsøg og hvordan forløber dette?

Answer 7

For at finde ud af om et kemikalie er akut toxisk kan man lave en række forsøg som kaldes for ”the fixed dose”. Her giver man kemikaliet i forskellige doser og ser hvor mange der dør. Når man har givet den højeste dosis og der efter 14 dage ikke er sket en reaktion vil man kalde det for ikke toksisk.

Question 8

Hvilke dyrearter bruges til fixed-dose procedure?

Answer 8

Man kan bruge forskellige dyrearter i forhold til testens formål.

Question 9

Hvor mange dyr bruges til hvert dosisniveau i fixed-dose procedure?

Answer 9

10 dyr til hvert dosis niveau.

Question 10

Hvad er dosis niveauerne i fixed-dose procedure?

Answer 10

5, 50, 500 og 2000 mg/kg

Question 11

Hvor lang tid varer fixed-dose procedure forsøget?

Answer 11

fra 24 timer til 14 dage.

Question 12

Hvad er formålet med Repeat dose toxicity forsøg?

Answer 12

Dette forsøg laves for at finde den dosis hvor der ikke længere er en effekt.

Question 13

Hvor lang tid varer Repeat dose toxicity forsøg?

Answer 13

Oftest 28 eller 90 dage.

Question 14

Hvilke dyrearter anvendes til Repeat dose toxicity?

Answer 14

To forskellige dyrearter hvor den ene ikke skal være en gnaver.

Question 15

Hvilken kurve kan man lave på baggrund af Repeat dose toxicity?

Answer 15

En dosis-responskurve

Question 16

Hvad kan man finde ud fra en dosis respons kurve?

Answer 16

LOAEL (low adverse level) som er den laveste dosis der giver et signifikant respons.

NOAEL (no adverse effekt level) som er den dosis hvor der ikke er en statistisk forskel til kontrollen. NOAEL afhænger af hvilken dosis forsagsudføren har valgt.

Question 17

Hvad er BMD (Benchmark dose) og hvordan beregnes den? Hvad skal man tage højde for når man fastlægger BMD?

Answer 17

En grænseværdi man kan beregne ved kurve fitting af nogle data’er. Her bestemmer man hvor mange dyr man vil acceptere reagere på en pågældende dosismængde. Man skal tage højde for spredningen når man fastlægger BMD.

Question 18

Hvilke forsøg laves, når man kigger på reproduktion og beskriv disse forsøg?

Answer 18

1. Et forsøg hvor man eksponerer dyr helt fra befrugtningen og kigger på det gennem generationer. Her vil man kigge på alle parameter som er relevante for reproduktionen. Da man kører to generationer igennem vil man kunne undersøge alle trin i cyklusen. Dette forsøg kræver dog rigtig mange forsøgsdyr.
2. Et teratoginetests studie hvor man kigger på misdannelse af fostre. Man går altså ind og kigger på udviklingen af fostre. De fleste vitale organer udvikler sig i midten af drægtigheds perioden.

Question 19

Hvad er mutagener?

Answer 19

Kemiske stoffer, der er i stand til at reagere med cellens DNA og der ved fremkalde mutation som kaldes mutagener.

Question 20

Nævn 3 måder hvorpå mutationer kan foregår?

Answer 20

1. Frame-shift mutation
2. DNA streng hvor der er forsvundet en base, hvilket giver en anden nukleotid sammensætning.
3. DNA streng hvor der er sket en addering, der er tilsat et nyt basepar. Dette vil også ændre nukleotid sammensætningen

Question 21

Hvilke tests kan man lave for at undersøge, hvorvidt der er sket en mutation?

Answer 21

Ames test (bacteriel gen mutation)
Chromosome aberration
Mammalian gene mutation

Hvis ingen af de overstående test er positive går man videre til at lave in vivo test som f.eks.:
Micronucleus test

Question 22

Hvad går Ames test ud på?

Answer 22

Går ud på at se om der er vækst på forskellige agar. Hvis der kommer vækst på Histidin frit medie vil der være opstået en pludselig mutation.

Question 23

Hvad går Chromosome aberration ud på?

Answer 23

Med denne test vil man direkte kunne se om der er sket noget på selve kromosomet, nærmere bestemt hvorvidt der er sket en ændring i kromosomets form eller antal. Der kan enten være tale om en afspaltning af kromosom eller en indsnævring mm.

Question 24

Hvad går Mammalian gene mutation ud på?

Answer 24

Denne test kan undersøge om en række kemikalier er i stand til at lave DNA skade som fører til en gen mutation.
Her vil man f.eks. bruge nogle cellelinjer som indeholder 6-thioguanine, da det er toksisk mod celler med genet HGRT. Dette skyldes at HGRT vil omdanne 6-thioguanine og den metabolit der kommer vil slå cellen ihjel. På den måde kan man se at hvis der er vækst vil der være sket en mutation af HGRT som gør at den ikke vil omdanne 6-thioguanine og derfor vil cellen ikke blive slået ihjel.

Question 25

Beskriv princippet i Micronucleus test

Answer 25

Ved genetiske skader kan der formes mere end mikronucleus og man ønsker således at undersøge de pågældende lægemidlers kromosomale effekt.
Musene eksponeres for test substans og aflives herefter. Der udsuges så benmarv fra lårknoglen og blodcellerne analyseres for kromatinrester (mikronukleui).

Question 26

Hvad er fordelen og ulempen ved at anvende Micronucleus test?

Answer 26

Fordelen: At stoffet kommer hele vejen igennem dyret så man får alle kroppens metaboliske påvirkninger med.

Ulempen: Man skal ofre en mus hver gang man skal teste et stof.

Question 27

Hvad hedder de test man går videre med, hvis testene for mutagenisitet viser noget?

Answer 27

Carcinogenisitet test

Question 28

Hvad er carcinogene stoffer?

Answer 28

Stoffer som øger tumor incidensen (antallet af nye tumor tilfælde i befolkningen).

Question 29

Carcinogene stoffer kan opdeles i to grupper - hvilke?

Answer 29

Genotoksiske carcinogener

Non-genotoksiske carcinogener

Question 30

Hvad er et genotoksisk karcinogen?

Answer 30

Genotoksisk karcinogen angiver et kemisk stof, der er i stand til at producerer cancer ved direkte at ændre målcellers genetiske materiale. Den direkte interaktion med DNA sker gennem dannelsen af kovalente bindinger, hvilket resulterer i DNA-kræftfremkaldende komplekser. Disse komplekser fører til forskellige typer af DNA-skader og dermed en ændring af informationslagret i DNA. Sådanne mutationer repareres typisk ved DNA-repair mekanismer, men hvis DNA replikationen finder sted før virkningen af DNA reparaitions mekanismen, kan mutationerne blive permanente og i sidste ende forårsage tumorer.

Question 31

Hvad er et et non-genotoksisk karcinogen?

Answer 31

Non-genotoksiske karcinogener har ikke nogen direkte interaktion med DNA og er derfor ikke relateret til at forårsage direkte genskade. De menes i stedet at være i stand forårsage tumorer ved nogle sekundære mekanismer – herunder ved at forstyrre cellulære strukturer og ved at ændrer hastigheden af enten celleproliferation eller processer, der øger risikoen for genetiske fejl.

Question 32

Er en promotor mutagen?

Answer 32

Nej

Question 33

Hvordan udføres en hudirritationstest?

Answer 33

Teststof anvendes på øjet eller huden forsøgsdyr, der oftest er albinokaniner. Teststoffet efterlades i et tidsrum før det til sidst skyldes af og effekten kan måles. Dyrene observeres for rødme, ødem, hævelse, sårdannelse, udflåd, uklarhed eller blindhed. Dyrene aflives efter testen, hvis stoffet har bevirket uoprettelig skade. Hvis ikke kan dyret genbruges efter en afvaskningsperiode, hvor forrige teststof får lov til at dispergere fra teststedet.

Question 34

Beskriv princippet for fastlæggelse af en MRL

Answer 34

ADI skal oversættes til MRL, hvor man prøver at tage hensyn til at stofferne fordeler sig forskelligt i forskellige væv, såsom nyrer, lever, muskel og i fedtvæv. Når man ligger koncentrationerne sammen i disse væv, skal ADI værdien være under disse. MRL værdier er den maksimale restkoncentration af et stof, der accepteres i animalske fødevarer.

Question 35

Gør rede for hvilke tests der normalt gennemføres for at vise om en lægemiddelkandidat ikke er carcinogen.

Answer 35

Den konventionelle test for carcinogenecitet er den langsigtede (long-termed) gnaver carcinogenecitets bioassay. Formålet med denne test er at observere forsøgsdyerne i en stor del af deres levetid for udviklingen af neoplastiske læsioner under eller efter udsættelse for forskellige doser af et teststof. Undersøgelsen udføres sædvanligvis ved anvendelse af to arter – rotter og mus af begge køn. Dyrerne doseres med oral, dermal eller inhalations eksponeringer baseret på den forventede type eksponering. Dosering varer typisk omkring 2 år.

Carciogenesis er en kompleks proces og intet enestående studie kan forventes at forudsige det carcinogene potentiale af et stof. Den grundlæggende ordning omfatter long-term gnaver carcinogene studier plus et anden lang eller kort-sigtet studie, som bidrager med information, der ikke forekommer i det første studie. Der er flere grunde til at vælge et kort-sigtet studie som supplement til det 2årige bioassay (long-term studie).

Question 36

Hvad er forskellen på en initiator og en promotor i relation til carcinogenese?

Answer 36

Initiatorer virker i det første to trin i udviklingen af cancer. Initiatorer kan forårsage ændringer i DNA, altså mutationer. Da mange initiatorer først skal metaboliseres i kroppen før de bliver aktive, er initiatorer ofte vævsspecifikke. Effekten af initiatorerne er irreversible; når først en celle er blevet påvirket af en initiator, vil den være modtagelig overfor påvirkning af promotorer frem til dets død. Da initiation er resultatet af en permenent genetisk ændring, vil alle datterceller produceret af den muterede celle også bære mutationen.

Når en celle er blevet muteret af en initiator, er den modtagelig for virkningen af promotorer. Disse forbindelser fremmer proliferation i cellen, hvilket giver anledning til et stort antal datterceller indeholdende mutationen skabt af initiatorer. Promotorer har ingen effekt, hvis ikke cellen før har været behandlet af initiator og derfor kan promotorer altså ikke give kræft alene.
I modsætning til initiatorer behøver promotorer ikke binde til DNA. Mange promotorer binder i stedet på overfladen af cellen, for på den måde at påvirke intracellulære signalveje i cellen, som fører til celleproliferation. Promotorer er ofte specifikke for en bestemt art eller et bestemt væv på grund af deres interaktion med receptorer, der er til stede i forskellige mængder i forskellige vævstyper.

Question 37

Hvordan undersøges for akut toksicitet?

Answer 37

Fixed dosed procedure. Metode til at vurdere et stofs akutte orale toksicitet.
Fidusen er, at man tester dosis. Teststoffet gives på en af de faste dosis niveauer (fixed dose) på 5, 50, 500 og 2000 mg/kg til 5 hamrotter og 5 hunrotter. Målet er at identificere den dosis, der giver klare toksikologiske tegn, men ingen dødelighed. Hvorvidt man går videre i testen afhænger af resultatet af første dosis, men hvis første dosis ikke giver tegn på toksisitet er det nødvendigt at genteste med højere dosis.

Denne test ligner meget den ældre LD50 test, men i fixed dose procedure anvender man færre dyr og forårsager mindre smerte og lidelse.

Question 38

Hvad er forskellen på et reproduktionsstudie og et teratogenicitetsstudie? Beskriv hvordan de udføres og angiv hvilke dyrearter, der anvendes

Answer 38

Hvis man blot tester på en generation, vil man ikke have mulighed for at undersøge dyrs reproduktionsevne, som har været udsat for et givent teststof prænatalt og frem til puberteten. Derfor er det nødvendigt, at undersøge mere en én generation. Minimum antal generationer, der er nødvendig for at give klare resultater, som der kan fortolkes på, er to generationer. I disse multigenerations undersøgelser ser man på et teststofs virkning på fertalitet, frugtbarhed, prænatal toksitisitet, laktation og fravænning.
I tetragenicitetsundersøgelser ser man på inducerende effekter under graviditeten, føtal/embryo tokcititet. Når man udfører udviklingstest og den viser tetragenicitet, tester man for hvorvidt tetrageniciteten sætter ADI. Hvis dette er tilfældet vil man derefter teste en anden dyreart og se på om denne dyreart viser større følsomhed overfor de udviklingsmæssige effekter.
Rotter, mus og kaniner.

Question 39

Hvordan aktiveres et pre-carcinogen og hvordan fremkalder det cancer?

Answer 39

Et carcinogen er en agent (fysisk, kemisk eller biologisk) og kan forøge forekomsten af maligne neoplasmer. Precarcinogener aktiveres efter det er blevet ændret ved metaboliske processer (af cyrochrom P450).

Question 40

Hvordan bestemmes en Benchmark dose.

Answer 40

BMD bestemmes ved bestemte procenter af respons. F.eks. er BMD5 den dosis, hvor 5 % af dyrene har symptomer på indgiften. Amerikanerne bruger BMD10, pointen er at man accepterer et mindre respons på indgiften. Der er altid en usikkerhed når man bestemmer sådan noget, man bruger derfor LBMD5 i stedet for den ”rene” BMD5, hvor LBMD5 er den nederste grænse i konfidensintervallet for BMD5.
BMD10 er et mildere krav end BMD5. På samme måde er BMD1 et strengere krav end BMD5.

BMD bruges til at bestemme ADI. Det gøres på samme måde, bare erstat NOADL med BMD så: ADI=Benchmarkdose/Safety factor.