Tema 12 - Interacción primaria Flashcards
¿Qué diferencias hay entre la interacción primaria y secundaria?
La interacción primaria se produce la union entre un Ag monovalente y un Ac mono/bivalente; no es una interacción visualizable por lo cual no genera precipitación ni aglutinación como la interacción secundaria.
Los métodos para visualizar la interacción primaria requiere de utilizar algún revelador, cromóforo, y por una reacción enzimática.
El Ag o Ac se encuentra marcado de alguna manera.
Escriba la interacción primaria desde su enfoque cinético
Ag + Ac <–> Ag-Ac
vd=Kd[AcAg]
t1/2=ln2/Kd
¿Qué sucede cuando se llega al equilibrio entre la velocidad de formación del complejo y su disociación?
la velocidad de formacion es igual a la velocidad de disociacion, es decir, Va=Vd. Entonces haciendo la relación matemática tenemos que=
Ka.[Ac][Ag] = Kd.[Ag-Ac]
Ka/Kd = [Ag-Ac]/[Ag].[Ac] = K (cte de afinidad)
SOLO K EN EL EQUILIBRIO
¿Qué sucede en un sistema complejo con AcPo?
En este caso, un mismo Ag podría presentar más de una epitope en su membrana que es reconocido por los ≠ Acs, entonces estos Acs se unirán al mismo Ag pero por distintos epitopes teniendo cada interacción una K de afinidad diferentes, pasa a llamarse
K avidez = K1xK2
¿Cuáles son los parámetros de la interacción primaria?
1) K
2) q
3) Ctes cinéticas (Ka; Kd; t1/2)
¿Qué es el equilibrio de diálisis?¿Para qué sirve?
Colocando un Ag hapténico en una cámara separada por una membrana semipermeable, si de un lado se encuentra en mayor cc que del otro el Ag es capaz de difundir libremente a través de la cámara hasta llegar el equilibrio.
Mientras que colocando un Ac al otro lado de la membrana, este no es capaz de difundir. Bajo estas condiciones es posible determinar la cc del Ag conociendo la concentración incial del mismo asi como del Ac.
CALCULAR LA K
¿Cómo se determina la K por equilibrio de dialisis?
Sabemos que K = [Ac-Ag]/[Ac].[Ag]
[Ac-Ag] = B (binding)
[Ag] = free (F)
[Ac] = q (sitios totales de unión) - B (sitios ocupados)
Queda K = B/(q-B)(F) … reordenando … B/F = K.q x K.B pudiendo realizar una recta para AcMO donde la pendiente, m=K y la ordenada al origen K.q
Con los AcPo se forma una hipérbola, donde su análisis se vuelve más difícil pudiendo determinar Ka promedios.
Mencione el fundamento de radioinmunoanálisis (RIA)
Consiste en la inhibición competitiva de la unión de un Ag marcado (Ag*) a su Ac específico por parte del Ag no marcado.
¿Cual es la utilidad del RIA?
Establecer la concentración de Ag de una muestra incógnita que se encuentran en baja cc.
Mencione las ventajas y desventajas de la técnica RIA
Ventajas:
1) Alta sensibilidad
2) Sencilles
3) Versatilidad
4) Cuantitativo
Desventajas:
1) La persona debe estar calificada para realizar el ensayo
2) Costoso
Menciones los requisitios del RIA
1) Ag* altamente radiactivo para usarlo en bajas cc.
2) El Ac debe unirse indiscriminadamente al Ag y Ag* con una alta especificidad y afinidad, y hallarse en baja cc.
3) La interacción obedece el equilibrio de masas, y se debe llegar a un equilibrio de reacción.
4) El método de separacion del Ag* y el complejo Ag-Ac no debe afectar el equilibrio.
Mencione la secuencia experimental del RIA
1) Titulación de Acs
2) Ensayo de desplazamiento
¿Qué métodos de separación conoce?
Utilizar polietilenglicol (PEG) o proteína A unida a sefarosa.
¿Con qué dilución se trabaja para el desplazamiento en RIA? ¿Por qué?
Cuando se realiza el gráfico de B=f(dilución de suero) se interpola hacia la dilución en que se obtenga el 50% de la señal. De esta manera obtengo un área de mayor sensibilidad cuando agregue el Ag de la muestra para desplazar Ag*-Ac evidenciando grandes cambios a pequeñas cantidades de Ag competidor.
¿Qué es la resonancia plasmonica de superficie (SPR)?
Es una técnica que permite realizar el análisis en tiempo real de la interacción entre moléculas.
