Technologie de l'ADN Flashcards
où coupe l’enzyme nucléase
lien phosphodiester entre 2 nucléotides
V ou F
pour qu’une exonucléase puisse agir, elle doit s’associer à la molécule d’ARN ou ADN à son extrémité 5’ exclusivement
F
doit être à une extrémité msis peut aller de 3@5 aussi
endonucléase clive où
milieu de la chaîne: produit fragments
action des endonucléase de restriction
clive aux sites de restrictions (séquences nucléotides spécifiques) de l’ADN double brin
V ou F
les bactéries possèdent des enzymes de restrictions
V
pour se défendre contre virus
type de la séquence ci-dessous:
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’
séquence palindromique (se lit pareil ds 2 directions)
séquences de restrictions en majorité reconnues des enzymes de restrictions
séquences palindromiques
2 types de résultats qui suivent le clivage d’une enzyme de restriction
- bouts france (chop en 2 en une coupure droite)
- bouts collants (chop après le 1er nucléotide de chaque brin)
premier outil al caractériser les gènes et ADN dans les années 70
enzymes de restrictions (Restriction mapping dans les organismes et virus)
comment on sépare les fragments d’ADN selon leur taille après digestion
électrophorèse sur gel d’agarose:
plus lourds restent près du pôle - car plus lent et plus léger contraire migrent rapidement vers pôle + (ADN est chargé négativement)
on utilise quoi pour visualiser les plaques de gel d’agarose où ont migré plusieurs séquences ADN
Bromure d’ethidium (molécule fluo) s’intercale dans la double hélice et est visible qd on projette lumière UV
processus de ligation
on peut joindre 2 fragments d’ADN grâce à une ligase et ATP à partir des bouts cohésifs compatibles (on rematch les bouts collants ou francs)
V ou F
la ligation des bouts collants est moins efficace que celle des bouts francs
F, francs plus difficile pcq aléatoire; pour qu’ils entrent en contact ils doivent entrer en collision.
Bouts collants s’apparient, stabilisent les interactions donc 100x plus efficace
ADN recombinant
ADN qui résulte de la ligation de 2 séquences coupées par enzyme de restriction
clonage d’ADN (cloning)
on met l’ADN recombinant (ligation de 2 bouts ayant été clivés par enzyme de restriction) dans un vecteur d’ADN qui pourra faire des réplications autonomes:
on perpétue l’ADN recombinant
plasmide
cercle d’adn double brin qui se réplique par lui-même, façon autonome
Vecteur
plasmide (adn double brin qui se réplique autonome) qui contient des séquences ADN pour
- l’origine de réplication de la bactérie
- un gène de sélection (résistance antibiotiques) pour sélectionner juste les bactéries porteuses du vecteur
- site multiclonage
Processus de transformation
insertion d’un plasmide dans souche de bactérie ou levure
comment on sait quelle cellule a reçu le plasmide dans un peocessuse de transformation et sélection
on leur ajoute un marqueur de sélection qui code pour antibiotique (comme ampicilline) et après,
on les met dans un antibiotique => si résiste: on sait que c’est le plasmide qui contient l’antibiotique
est-ce que la transformation d’un plasmide (insertion dans bactérie ou levure) est efficace
non, 1/2000
pourquoi on amplifie l’ADN (par transformation dans une bactérie et clonage dans plasmide)
- séquencer ADN (prep bcp d’inserts)
- faire d’autres copies du plasmide (un autre clonage)
- produire protéines recombinantes
insuline humaine, hormone de croissance humaine, facteurs de coagulation, immunogènes dans les vaccins et lactase sont tous produits grâce à quelle méthode de technologie d’adn
amplification ADN qui fait des protéines recombinantes
comment on produit des protéine recombinantes à des fins de soins médicaux
on choisit d’abord un vecteur d’expression qui porte un promoteur (séquence où la transcription commence)
- endonucléase de restriction coupe le vecteur avant le promoteur
- insertion d’une séquence ADN codante pour prot par ligation
- clonage
- transformation plasmide dans une bactérie
- prot exprimée en grande qté; surexpression
- purification de la protéine
on utilise quoi comme ammorce pour l’ADN polymérase pour une polymérisation in vitro
oligonucléotide ADN ou ARN à l’extrémité 3’ du brin d’ADN en polymérisation
différente entre la matrice utilisée pour la polymérisation in vivo VS in vitro
in vivo: simple brin de l’hélice qui a été ouverte par l’hélicase
in vitro: simple brin d’ADN est synthétique/phagique par la dénaturation thermique
que se passe-t-il avec une séquence d’ADN exposée à un milieu où la température ou le pH augmente
double hélice devient hélice simple => absorbance augmente et peut être mesurée en lab
V ou F
dénaturation d’un ADN avec beaucoup de séquences A-T a lieu a une température plus élevée qu’un ADN avec bcp de séquences GC
F
moins de température pcq liaisons moins fortes
V ou F
la dénaturation d’un double brin d’ADN est irréversible
F
les simples brins peuvent se renaturer en se ré-hybridant en ADN double brin quand on revient aux conditions initiales
hybridation résulte de quoi
dénaturation: hélice 2 brins split, renaturation: 2 brins se re-apparie mais peuvent originer de 2 hélices initiales différentes
quel est le brin complémentaire (amorce) et la matrice dans la synthèse de l’ADN in vitro
amorce = oligonucléotide matrice = ADN simple brin
méthode pour détecter une mutation dans un gène
méthode de Sanger
qu’est-ce qui permet normalement l’extension à l’extrémité 3’ d’un nucléotide
groupement OH => désoxyribonucléotide dNTP normal
si pas de OH => mutation: didéoxyribonucléotide ddNTP (terminaison, pas d’extension à 3’ possible)
comment on détermine la séquence d’un fragment d’ADN
- sépare les brins
- ajout d’amorces & désoxyribonucléotides dNTP dans 4 tubes différents (dA, dC, dG, dT)
- on marque un des dNTP pour détecter un ddNTP (terminaison) par tube
- ajout de l’ADN polymérase
- polymérisation
- séparation sur gel agarose
- on détecte les brins synthétisés par nos amorces qui on subit une extension et on peut lire la séquence sur le gel
PCR
polymerase chain rxn
cycle de PCR
- séparation des brins à haute température (95˚C)
- hybridation des amorces à 55˚C
- synthèse par ADN polymérase soit E coli (37˚C) ou Termus aquaticus Taql (72˚C)
V ou F
la spécificité d’une amorce est indépendante de sa longueur
F
+ longue = + spécifique à la matrice, moins de chance qu’elle reconnaisse plusieurs endroits dans le génome tout confus
quels types de séquences sont utilisés dans le DNA fingerprinting en médecine légale
short et long tandem repeats
STR = 2-6 nucléotides
VNTR = 10-100 nucléotides
On amplifie l’ADN à partir de cheveux/sang/cellules de peau
c’est quoi le polymorphisme dans les STR et VNTR (séquences junk répétées en tandem)
nombre de séquences répétées vraiment variable chez chaque individu => propre à chacun
qu’est-ce qui compose la majorité des variations génétiques humaines (90%)
polymorphisme d’un seul nucléotide SNP
V ou F
la séquence ADN de 2 personnes différentes est 90% différente
F majoritairement similaire (99.9%)
tout se joue dans le 0.1% restant => variations individuelles qui affectent les risques de maladie chez un individu
=> on parle de séquences de polymorphisme de nucléotides simples
qu’est-ce qui créé le motif ADN unique à chaque personne
SNP (snip) => variation génétique transmise héréditairement
variation de base d’ADN chez moins qu’un % d’une population précise
mutation
si plus d’un % d’une population est doté d’une variation de base d’ADN, on parle de quoi
SNP => c’est pas une variation aléatoire mais toute la pop est affectée
quel gène, lorsque porteur de variation, est responsable d’un cancer du sein
BRCA-1
augmente risque de cancer du sein x7
dans quel cas on peut être atteint de fibrose kystique
homozygote pour un allèle où il manque 3 nucléotides CTT dans un site spécifique (s’il manque cette séquence dans les 2 chromosomes)
traits génétiques influencés par les SNP
couleur yeux/ cheveux perfo musculaire comportement social hérédité maladies réponse médicaments
SNP qui cause un trait génétique
SNP causatifs
qu’est-ce que les SNP des régions codantes affectent
séquence + fonction protéines
qu’est-ce que les SNP des régions non-codantes affectent
épissage pré-ARNm
régulation gène
niveau expression
SNP à proximité d’un gène qui cause un trait génétique précis qui agissent comme marqueur et ne sont pas à l’origine (cause) du trait
SNP liés
SNP codants et non-codants sont des types de SNP ___
causatifs
haplotype
bloc de variations d’ADN héritées ensemble , combinaison d’allèles ou ensemble de SNPs sur le même chromosome
*séquence qui revient chez plusieurs individus
Projet HapMap
on veut trouver les régions du gène qui affecte un phénotype comme une maladie/ réponse à un traitement sans avoir à examiner tous les SNPs d’un individu (diminuer le nb analysé de moitié)
MÉDECINE PERSONNALISÉE
que permet le HapMap
- prédire si un individu va développer une maladie par test génétique
- prédire susceptibilité des maladies dans une population en notant les différences génétiques entre pop
- traitements personnaliser prévention ou délai de maladie
que permet la médecine personnalisée et comment
analyse moléculaire pour choisir un médicament spécifique pour un patient + efficace pour son contexte génétique et environnemental
