Techniki cytogenetyczne Flashcards
Kariotyp to
zestaw chromosomów charakterystyczny dla danego gatunku
Badanie kariotypu to
Klasyczne badanie cytogenetyczne oparte na analizie liczby i struktury chromosomów w pojedynczym jądrze komórkowym
Na ocenę czego pozwala kariotyp?
Nieprawidłowości
- w liczbie (LICZBOWE ABERRACJE chromosomowe)
- w budowie chromosomów (STRUKTURALNE ABERRACJE chromosomowe)
Jakie komórki potrzebujemy do badania kariotypu?
Dzielące się, zatrzymane na etapie metafazy lub prometafazy
kondensacja chromatyny jest najwyższa, a tym samym struktura chromosomów najlepiej dostrzegalna
Przygotowanie materiału cytogenetycznego do analizy kariotypu:
- Założenie krótkoterminowej hodowli komórkowej z materiału pacjenta
- Zahamowanie podziałów komórkowych na etapie metafazy poprzez dodanie do trwającej hodowli kilku kropli kolchicyny lub kolcemidu
- Komórki zawieszane są w roztworze hipotonicznym - zawartość komórki i jądra kom. (w tym chromosomy) uwalniane są do roztworu
- Wirowanie roztworu - pozbycie się zbędnych rzeczy
- Chromosomy metafazowe i pozostałe interfazowe jądra komórkowe są utrwalane w r-r metanolu i kwasu octowego i przenoszone na szkiełko podstawowe
- Odbarwienie uwidaczniające strukturę chromosomów
Co robi kolchicyna lub kolcemid?
Degradują włókna wrzeciona kariokinetycznego
Jaki materiał pacjenta w diagnostyce onkologicznej?
Szpik kostny, tkanka guza
Jaki materiał pacjenta w diagnostyce prenatalnej?
płyn owodniowy, kosmówka, krew pępowinowa
Jaki materiał pacjenta w diagnostyce wrodzonych zespołów o podłożu genetycznym?
Krew obwodowa lub fragment skóry
Jakie barwienie jest rutynowo stosowane w badaniu kariotypu?
GTG z wykorzystaniem barwnika Giemsy i trypsyny
Chromosomy metafazowe wstępnie ulegają trawieniu trypsyną w celu pozbycia się części białek histonowych i rozluźnienia struktury chromatyny -> lepszy dostęp do właściwej struktury DNA
Potem barwienie barwnikiem Giemsy
Charakterystyczny wygląd w barwieniu GTG
Jasne końce chromosomów i leżące na przemian jasne i ciemne prążki
Każdy chromosom ma swój wzór prążkowy
Ciemne prążki w GTG
= bogate w pary nukleotydów AT, DNA wcześnie kondensujące i późno replikujące, z dużą zawartością genów tkankowo specyficznych
Jasne prążki w GTG
= bogate w pary nukleotydów GC, bardzo aktywne transkrypcyjnie, DNA późno kondensujące i wcześnie replikujące z dużą zawartością genów metabolizmu podstawowego (house-keeping genes)
Inne barwienia w badaniu kariotypu
Barwienie R
Barwienie AgNOR
Barwienie T
Barwienie R (kariotyp)
- odwrotność GTG - pozwala na identyfikację aberracji zlokalizowanych w dystalnych regionach chromosomów
Barwienie AgNOR (kariotyp)
- identyfikacja organizatorów jąderka i aberracji zlokalizowanych w krótkich ramionach chromosomów akrocentrych
Barwienie T (kariotyp)
- identyfikacja sekwencji telomerowych
disomia jednorodzicielska (UPD) - definicja
Obydwa chromosomy homologiczne pochodzą od jednego z rodziców
Która para chromosomów to płciowe + ich synonimy
23, allosomy, heterosomy, heterochromosomy
Chromosomy metacentryczne - lista
1-3, 16, 19, 20, X
Chromosomy subcentryczne - lista
4-12, 17, 18
Chromosomy akrocentryczne - lista
13-15, 21, 22, Y
Wynik kariotypu - zapis
Aberracje heterochromosomów przed autosomami
Aberracje liczbowe przed strukturalnymi
Liczba w [ ] to liczba analizowanych, metafazowych jąder komórkowych
Ile metafaz zanalizować by wg ISCN 2016 było wiarygodnie?
10-20 co najmniej
Maksymalna rozdzielczość klasycznego kariotypu
850 prążków - granica detekcji mikroskopu świetlnego; do 4Mpz (4mln pz)
(na ogół wynosi 500-750 prążków, umożliwia ujawnienie nieprawidłowości w materiale o wielkości 5-10Mpz)
Podstawowa technika cytogenetyki molekularnej
FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
Na co pozwala FISH?
detekcję w materiale pobranym od pacjenta określonej sekwencji DNA za pomocą sond fluorescencyjnych
Może być na jądrze interfazowym, przy braku podziałów komórkowych (no i na metafazowym)
Sonda FISH to:
syntetyczny fragment DNA połączony z barwnikiem fluorescencyjnym
Łączy się komplementarnie z docelową sekwencją DNA pacjenta
Przygotowanie materiału do analizy FISH:
- Usunięcie cytoplazmy i utrwalenie interfazowych lub metafazowych jąder na mikroskopowym szkiełku podstawowym
- Denaturacja sondy i badanego DNA
- Kilkugodzinna hybrydyzacja sondy i DNA pacjenta
- Detekcja sygnałów w mikroskopie fluorescencyjnym
Rozdzielczość FISH
zależy od długości sond - najczęściej to 120-600kpz
2 rodzaje sond w FISH:
- prążkowo specyficzne
- malujące
Sondy prążkowo specyficzne w FISH - kiedy stosowane?
W diagnostyce zespołów mikrodelecyjnych (aberracje chromosomowe w postaci DELECJI, często na granicy rozdzielczości mikroskopu świetlnego)
W onkologii (detekcja wybranych translokacji)
FISH włókienkowy:
pozwala na detekcję zmian z dokładnością nawet do 1kpz
Sonda hybrydyzuje do odbiałczonych włókien DNA
Wyznakowanie centromerów w FISH - jak?
Wybrane lub wszystkie
Dzięki wspólnej 171-nukleotydowej sekwencji alfa-satelitarnego DNA tworzącej centromer
Sondy dla centromerów:
-długość 200-500kpz
Wyznakowanie centromerów w FISH - kiedy?
W diagnostyce prenatalnej (np. oznaczenie PŁCI, LICZBOWYCH aberracji chromosomowych)
W diagno onkologicznej (np. mikrochimeryzm poprzeszczepieniowy, chromosomy dicentryczne, neocentryczne)
Sondy do diagnostyki onkologicznej, charakterystyczne dla regionów telomerowych
sondy molekularne komplementarne do sekwencji TTAGGG
Sondy malujące w FISH
Wybarwiają całe chromosomy lub poszczególne ramiona
Przydatne do:
- badania TRANSLOKACJI, zwłaszcza złożonych
- określania pochodzenia dodatkowego materiału w nieprawidłowych chromosomach
- określania pochodzenia chromosomów markerowych
Wymagają chromosomów metafazowych
SKY-FISH, M-FISH to
wybarwienie wszystkich chromosomów dzięki kombinacji wielu fluorochromów
Wymaga chromosomów metafazowych
Wynik FISH wg ISCN 2016
podanie liczby obserwowanych w mikroskopie fluorescencyjnym sygnałów od sondy lub oznaczenie “+”, “-“ czy jest czy nie ma sygnału
ish - ocena chromosomów metafazowych
nuc ish - ocena interfazowych jąder komórkowych
