Techniki cytogenetyczne

Question 1

Kariotyp to

Answer 1

zestaw chromosomów charakterystyczny dla danego gatunku

Question 2

Badanie kariotypu to

Answer 2

Klasyczne badanie cytogenetyczne oparte na analizie liczby i struktury chromosomów w pojedynczym jądrze komórkowym

Question 3

Na ocenę czego pozwala kariotyp?

Answer 3

Nieprawidłowości

• w liczbie (LICZBOWE ABERRACJE chromosomowe)
• w budowie chromosomów (STRUKTURALNE ABERRACJE chromosomowe)

Question 4

Jakie komórki potrzebujemy do badania kariotypu?

Answer 4

Dzielące się, zatrzymane na etapie metafazy lub prometafazy

kondensacja chromatyny jest najwyższa, a tym samym struktura chromosomów najlepiej dostrzegalna

Question 5

Przygotowanie materiału cytogenetycznego do analizy kariotypu:

Answer 5

1. Założenie krótkoterminowej hodowli komórkowej z materiału pacjenta
2. Zahamowanie podziałów komórkowych na etapie metafazy poprzez dodanie do trwającej hodowli kilku kropli kolchicyny lub kolcemidu
3. Komórki zawieszane są w roztworze hipotonicznym - zawartość komórki i jądra kom. (w tym chromosomy) uwalniane są do roztworu
4. Wirowanie roztworu - pozbycie się zbędnych rzeczy
5. Chromosomy metafazowe i pozostałe interfazowe jądra komórkowe są utrwalane w r-r metanolu i kwasu octowego i przenoszone na szkiełko podstawowe
6. Odbarwienie uwidaczniające strukturę chromosomów

Question 6

Co robi kolchicyna lub kolcemid?

Answer 6

Degradują włókna wrzeciona kariokinetycznego

Question 7

Jaki materiał pacjenta w diagnostyce onkologicznej?

Answer 7

Szpik kostny, tkanka guza

Question 8

Jaki materiał pacjenta w diagnostyce prenatalnej?

Answer 8

płyn owodniowy, kosmówka, krew pępowinowa

Question 9

Jaki materiał pacjenta w diagnostyce wrodzonych zespołów o podłożu genetycznym?

Answer 9

Krew obwodowa lub fragment skóry

Question 10

Jakie barwienie jest rutynowo stosowane w badaniu kariotypu?

Answer 10

GTG z wykorzystaniem barwnika Giemsy i trypsyny
Chromosomy metafazowe wstępnie ulegają trawieniu trypsyną w celu pozbycia się części białek histonowych i rozluźnienia struktury chromatyny -> lepszy dostęp do właściwej struktury DNA
Potem barwienie barwnikiem Giemsy

Question 11

Charakterystyczny wygląd w barwieniu GTG

Answer 11

Jasne końce chromosomów i leżące na przemian jasne i ciemne prążki
Każdy chromosom ma swój wzór prążkowy

Question 12

Ciemne prążki w GTG

Answer 12

= bogate w pary nukleotydów AT, DNA wcześnie kondensujące i późno replikujące, z dużą zawartością genów tkankowo specyficznych

Question 13

Jasne prążki w GTG

Answer 13

= bogate w pary nukleotydów GC, bardzo aktywne transkrypcyjnie, DNA późno kondensujące i wcześnie replikujące z dużą zawartością genów metabolizmu podstawowego (house-keeping genes)

Question 14

Inne barwienia w badaniu kariotypu

Answer 14

Barwienie R
Barwienie AgNOR
Barwienie T

Question 15

Barwienie R (kariotyp)

Answer 15

• odwrotność GTG - pozwala na identyfikację aberracji zlokalizowanych w dystalnych regionach chromosomów

Question 16

Barwienie AgNOR (kariotyp)

Answer 16

• identyfikacja organizatorów jąderka i aberracji zlokalizowanych w krótkich ramionach chromosomów akrocentrych

Question 17

Barwienie T (kariotyp)

Answer 17

• identyfikacja sekwencji telomerowych

Question 18

disomia jednorodzicielska (UPD) - definicja

Answer 18

Obydwa chromosomy homologiczne pochodzą od jednego z rodziców

Question 19

Która para chromosomów to płciowe + ich synonimy

Answer 19

23, allosomy, heterosomy, heterochromosomy

Question 20

Chromosomy metacentryczne - lista

Answer 20

1-3, 16, 19, 20, X

Question 21

Chromosomy subcentryczne - lista

Answer 21

4-12, 17, 18

Question 22

Chromosomy akrocentryczne - lista

Answer 22

13-15, 21, 22, Y

Question 23

Wynik kariotypu - zapis

Answer 23

Aberracje heterochromosomów przed autosomami
Aberracje liczbowe przed strukturalnymi
Liczba w [ ] to liczba analizowanych, metafazowych jąder komórkowych

Question 24

Ile metafaz zanalizować by wg ISCN 2016 było wiarygodnie?

Answer 24

10-20 co najmniej

Question 25

Maksymalna rozdzielczość klasycznego kariotypu

Answer 25

850 prążków - granica detekcji mikroskopu świetlnego; do 4Mpz (4mln pz)

(na ogół wynosi 500-750 prążków, umożliwia ujawnienie nieprawidłowości w materiale o wielkości 5-10Mpz)

Question 26

Podstawowa technika cytogenetyki molekularnej

Answer 26

FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Question 27

Na co pozwala FISH?

Answer 27

detekcję w materiale pobranym od pacjenta określonej sekwencji DNA za pomocą sond fluorescencyjnych
Może być na jądrze interfazowym, przy braku podziałów komórkowych (no i na metafazowym)

Question 28

Sonda FISH to:

Answer 28

syntetyczny fragment DNA połączony z barwnikiem fluorescencyjnym

Łączy się komplementarnie z docelową sekwencją DNA pacjenta

Question 29

Przygotowanie materiału do analizy FISH:

Answer 29

1. Usunięcie cytoplazmy i utrwalenie interfazowych lub metafazowych jąder na mikroskopowym szkiełku podstawowym
2. Denaturacja sondy i badanego DNA
3. Kilkugodzinna hybrydyzacja sondy i DNA pacjenta
4. Detekcja sygnałów w mikroskopie fluorescencyjnym

Question 30

Rozdzielczość FISH

Answer 30

zależy od długości sond - najczęściej to 120-600kpz

Question 31

2 rodzaje sond w FISH:

Answer 31

• prążkowo specyficzne

- malujące

Question 32

Sondy prążkowo specyficzne w FISH - kiedy stosowane?

Answer 32

W diagnostyce zespołów mikrodelecyjnych (aberracje chromosomowe w postaci DELECJI, często na granicy rozdzielczości mikroskopu świetlnego)

W onkologii (detekcja wybranych translokacji)

Question 33

FISH włókienkowy:

Answer 33

pozwala na detekcję zmian z dokładnością nawet do 1kpz

Sonda hybrydyzuje do odbiałczonych włókien DNA

Question 34

Wyznakowanie centromerów w FISH - jak?

Answer 34

Wybrane lub wszystkie
Dzięki wspólnej 171-nukleotydowej sekwencji alfa-satelitarnego DNA tworzącej centromer
Sondy dla centromerów:
-długość 200-500kpz

Question 35

Wyznakowanie centromerów w FISH - kiedy?

Answer 35

W diagnostyce prenatalnej (np. oznaczenie PŁCI, LICZBOWYCH aberracji chromosomowych)

W diagno onkologicznej (np. mikrochimeryzm poprzeszczepieniowy, chromosomy dicentryczne, neocentryczne)

Question 36

Sondy do diagnostyki onkologicznej, charakterystyczne dla regionów telomerowych

Answer 36

sondy molekularne komplementarne do sekwencji TTAGGG

Question 37

Sondy malujące w FISH

Answer 37

Wybarwiają całe chromosomy lub poszczególne ramiona
Przydatne do:
- badania TRANSLOKACJI, zwłaszcza złożonych
- określania pochodzenia dodatkowego materiału w nieprawidłowych chromosomach
- określania pochodzenia chromosomów markerowych

Wymagają chromosomów metafazowych

Question 38

SKY-FISH, M-FISH to

Answer 38

wybarwienie wszystkich chromosomów dzięki kombinacji wielu fluorochromów
Wymaga chromosomów metafazowych

Question 39

Wynik FISH wg ISCN 2016

Answer 39

podanie liczby obserwowanych w mikroskopie fluorescencyjnym sygnałów od sondy lub oznaczenie “+”, “-“ czy jest czy nie ma sygnału

ish - ocena chromosomów metafazowych
nuc ish - ocena interfazowych jąder komórkowych