Metody genetyki molekularnej

Question 1

Jaki materiał biologiczny do izolowania kwasów nukleinowych?

Answer 1

Krew na EDTA
kom. nabłonka (wymazy)
hodowla fibroblastów
komórki płynu owodniowego lub trofoblastu (badania prenatalne)
komórki szpiku kostnego (diagno ch. rozrostowych ukł. krwiotwórczego)
fragmenty innych tkanek, śladów biologicznych (do celów sądowych)

Question 2

Etapy izolacji kwasów nukleinowych z materiału biologicznego - rozwinięte

Answer 2

1.Liza komórkowa + denaturacja białek lub trawienie ich proteinazami -> mamy wyodrębnione cząsteczki kwasów nukleinowych zabezpieczone przed degradacją enzymatyczną
(jeżeli mamy litą tkankę to przed tym robimy wstępną homogenizację, najczęściej mechaniczną)

2. Oczyszczanie preparatu:
   np. -ekstrakcja organiczna przy zastosowaniu mieszaniny fenol:chloroform
   - wysalanie białek z otrzymanych lizatów komórkowych
   - związanie z nośnikami, oczyszczenie i uwolnienie związanego kw. nukleinowego (np. na złożach krzemionkowych)
   - separacja magnetyczna
3. Ocena ilościowa i jakościowa preparatów kwasów nukleinowych - najczęśćiej za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego w zakresie światła UV
   - kw. nukleinowe wykazują maksymalną absorbancję przy A=260nm (przez zasady purynowe i pirymidynowe)
   - określa się stężenie kw. nukleinowych w preparacie
   - stosunek A260nm/A280nm - stopień zanieczyszczenia białkami (wolne od zanieczyszczeń = 1,8 dla DNA, 2,0 dla RNA)

inne metody oceny: -wizualne techniki rozdziału kw. nukleinowych w żelu agarozowym (częściej RNA)
-metody fluoroscencyjne

Question 3

Etapy izolacji kwasów nukleinowych z materiału biologicznego - skrót:

Answer 3

1. Liza komórkowa + denaturacja białek lub trawienie ich proteinazami
2. Oczyszczanie preparatu
3. Ocena ilościowa i jakościowa preparatów kwasów nukleinowych

Question 4

Czego potrzebujemy do PCR? (6)

Answer 4

• termostabilna polimeraza DNA
• matryca DNA (badana próbka mat. genetycznego)
• startery oligonukleotydowe (dostarczenie polimerazie wolnych grup 3’-OH, wyznaczają region poddawany powielaniu
• trójfosforany deoksynukleotydów(dNTPs) = substraty z których polimeraza buduje nowe nici potomne
• bufor i woda
• jony Mg2+ (to kofaktory polimerazy)

Question 5

Etapy PCR (3)

Answer 5

1. Denaturacja dsDNA w wysokiej T (92-95C) - zerwanie wiązań wodorowych, DNA rozdziela się na 2 łańcuchy - każda z nici stanowi matrycę dla powstających fragmentów
2. Przyłączenie starterów (T 50-65C) - hybrydyzacja oligonukleotydów do komplementarnych sekwencji DNA
3. Wydłużanie nici (T optymalna dla polimerazy, zazwyczaj 72C) - komplementarne przyłączanie przez polimerazę nukleotydów w kierunku 5’->3’ do zhybrydyzowanych z nićmi DNA starterów

Powtórzenie kilkadziesiąt razy - wykładnicze zwielokrotnienie ilości DNA

Question 6

Modyfikacje PCR (4):

Answer 6

• PCR allelospecyficzny = amplifikasja allelospecyficzna (ASA)
• PCR multipleks
• analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP)
• reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Question 7

Amplifikacja allelospecyficzna (ASA) = ARMS

Answer 7

niekomplementarność nukleotydów przy końcu 3’ jednego lub obu stosowanych w PCR starterów zapobiega wydłużaniu końca 3’ startera
-> badany allel będzie amplifikowany tylko w przypadku pełnej komplementarności startera do matrycowego DNA

Question 8

Multipleks PCR

Answer 8

polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów mat. genetycznego przy użyciu wielu par oligonukleotydowych starterów w jednej mieszaninie reakcyjnej

• te odcinki mogą obejmować jeden lub wiele genów
• odcinki muszą różnić się długością, by dało się je rozróżnić elektroforetycznie

Question 9

PCR-RFLP = analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych - do czego używana?

Answer 9

• pozwala na detekcję znanych i opisanych wariantów o char. mutacji punktowych lub polimorfizmów genowych
• może być też używana w analizach porównawczych (np. ustalanie pokrewieństwa)

Question 10

PCR-RFLP = analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych - etapy

Answer 10

1. Amplifikacja PCRem fragmentu DNA obejmującego miejsce mutacji lub polimorfizmu
2. Trawienie produktu reakcji PCR enzymem restrykcyjnym
3. Dyskryminacja genotypów na podstawie wielkości produktów reakcji PCR-RFLP widocznych na żelu agarozowym po elektroforezie

Question 11

Co jest używane w analizie RFLP?

Answer 11

Endonukleazy restrykcyjne t.II - rozpoznają specyficzne sekwencje w dsDNA -> powstają ściśle określone fragmenty DNA pod względem długości, końców i struktury

Question 12

Techniki analizy heterodupleksów = HD

Answer 12

• oparte na denaturacji i ponownej losowej renaturacji mieszaniny produktów PCR składającej się z próby badanej i materiału referencyjnego
• jak jest zmiana punktowa w próbie badanej, to będziemy mieli zmianę w przestrzennej konformacji renaturowanych cząsteczek kw. nukleinowych
• tworzą się heterodupleksy(=nie do końca komplementarne dsDNA) i różnią się one szybkością poruszania w porównaniu do homodupleksów (=dsDNA w pełni komplementarne)

-używana w analizie heterodupleksów metodą denaturacyjnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej = DHPLC

Question 13

analiza heterodupleksów metodą denaturacyjnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej = DHPLC

Answer 13

• w tej technice rozdział mieszaniny analizowanych fragmentów DNA, uprzednio powielonych w PCR, odbywa się w kolumnie chromatograficznej w gradiencie czynnika denaturującego
• heterodupleksy mają mniejsze powinowactwo do złoża wypełniającego kolumnę - szybciej są wymywane w stos. do homodupleksów ->detektor to rejestruje
• dla analizowanego fragmentu DNA uzyskujemy charakterystyczny i powtarzalny profil wymywania ze złoża -> efektywne przeprowadzenie przesiewowego genotypowania

Question 14

Ilościowa technika PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) - generalne założenia

Answer 14

pozwala na ocenę liczby kopii danego fragmentu kwasu nukleinowego w badanej próbce na podstawie pomiaru fluorescencji

• ilość namnażanego produktu śledzi się w każdym cyklu (a nie tylko na koniec jak w normalnym PCR)
• najczęściej stosowany barwnik to cyjaninowy SYBR Green - świeci przy związaniu do dsDNA

-można zastosować specjalne startery i sondy fluorescencyjne - jeszcze większa specyficzność

Question 15

qPCR - etapy (4)

Answer 15

1.Początkowe cykle - przyrost produktu, ale fluorescencja nie przekracza poziomu tła

2. Cykl progowy(=Ct=treshold cycle) - ten w którym fluorescencja przekracza poziom tła
   - wartość Ct jest zależna głównie od początkowej ilości matrycy (bo przyrost wykładniczy)
3. faza logarytmiczna - fluorescencja rośnie wykładniczo
4. Faza plateau - wysycenie reakcji

Question 16

qPCR - kiedy stosowany?

Answer 16

Diagnostyka wirusologiczna:
-detekcja i miano HBV, HCV, CMV, EBV

Diagnostyka bakteriologiczna:

• testy szybko potwierdzające/wykluczające infekcje
• identyfikacja bakterii

Diagnostyka onkologiczna:

• genotypowanie i monitorowanie poziomu ekspresji transkryptu genu fuzyjnego BCR-ABL w przewlekłej białączce szpikowej czy PML-RARA w ostej białaczce szpikowej
• ocena liczby kopii genów w komórkach nowotworowych (np. genu HER2 w neo piersi)

Question 17

MLPA - rozwinięcie skrótu

Answer 17

technika multipleksowej reakcji PCR zależnej od ligacji sond

Question 18

Na co pozwala MLPA?

Answer 18

na identyfikowanie w genomie pacjenta:

• zmian liczby kopii materiału genetycznego = DELECJI lub DUPLIKACJI (metoda klasyczna)
• zmian o charakterze zaburzeń METYLACJI genomu (msMLPA)
• zmian poziomu EKSPRESJI genów (RT-MLPA)

Question 19

Ile fragmentów genomu poddaje się pojedynczej analizie w MLPA?

Answer 19

Około 40 wybranych fragmentów, mogą być w jednym lub kilku genach, w jednym locus chromosomowym lub na różnych chromosomach

Question 20

Zasada działania MLPA jest oparta na zdolności kwasów nukleinowych do…

Answer 20

hybrydyzacji, ligacji + zastosowanie PCR do amplifikacji

Question 21

Podstawą działania MLPA są

Answer 21

połówkowe sondy MLPA, specyficzne dla badanych obszarów genomu pacjenta

Question 22

Z czego zbudowane są połówkowe sondy MLPA?

Answer 22

• krótkiego, kilkunastonukleotydowego fragmentu, który może ulegać hybrydyzacji do komplementarnego odc. genomu pacjenta
• sekwencji komplementarnej do startera (forward lub reverse), umożliwiającego amplifikację sond w PCR

+ jedna z sond ma wstawkę oligonukleotydową, która dzięki różnej długości pozwala na identyfikację sondy na etapie analizy wyników

Question 23

Kiedy w MLPA nastąpi efektywna hybrydyzacja?

Answer 23

Tylko gdy w materiale gen. pacjenta będą sekwencje komplementarne do sond połówkowych
->hybrydyzacja, ligacja, amplifikacja w PCR

Question 24

MLPA - wyniki

Answer 24

Detekcja produktów i ich identyfikacja podczas elektroforezy kapilarnej
Wyniki interpretowane na podstawie algorytmów matematycznych

Question 25

Sekwencjonowanie DNA to

Answer 25

metoda polegająca na oznaczaniu porządku par zasad w sekwencji DNA
np. automatyczne sekwencjonowanie metodą Sangera = metoda “dideoksy”

Question 26

Sekwencjonowanie Sangera - co to?

Answer 26

Modyfikacja PCR, w której powielanie fragmentu sekwencji zachodzi przy użyciu startera komplementarnego tylko do JEDNEJ z nici DNA

Question 27

Co potrzebujemy do Sangera?

Answer 27

• starter komplementarny do JEDNEJ nici DNA
• dNTPs (trójfosforany deoksynukleotydów)
• tzw. terminatory = (ddNTPs) trójfosforany dideoksynukleotydów, pozbawione na końcu 3’ grupy -OH
• polDNA

Question 28

Terminatory w Sangerze - przyłączanie

Answer 28

Trójfosforany dideoksynukleotydów pozbawione na końcu 3’ grupy -OH
Po ich przyłączeniu do nowej nici (przez polimerazę) nie mogą wytworzyć wiązania fosfodiestrowego z kolejnym nukleotydem -> zakończenie syntezy nici

Question 29

Terminatory w Sangerze - interpretacja

Answer 29

Każdy jest oznakowany innym fluoroforem
Losowo przyłączane do nowych nici -> w wyniku PCR otrzymujemy pulę fragmentów różniących się długością
Rozdział elektroforetyczny produktów w żelach polimerowych za pomocą sekwenatorów -> mamy po kolei od najkrótszego + wiemy jaki nukleotyd jest na końcu

Question 30

Co to sekwenatory?

Answer 30

Urządzenia skł. się z elektroforezy+wzbudzania i detekcji fluorescencji

Question 31

Wynik rozdziału w Sangerze to

Answer 31

Chromatogram - wykres intensywności fluorescencji w czasie

Question 32

Sekwencjonowanie następnej generacji = NGS a Sanger

Answer 32

Sekwencja całego genomu w kilkanaście godzin - szybciej niż w Sangerze

Question 33

Sekwencjonowanie następnej generacji = NGS - zasada działania

Answer 33

Równoległe i wielokrotne przetwarzanie milionów matryc:

• kwas nukleinowy, którego sekwencję chcemy poznać, jest poddawany fragmentowaniu
• > przeprowadza się masową, wielokrotną analizę sekwencji każdego z fragmentów
• > kompletna sekwencja jest otrzymywana przez ułożenie konsensusu z przeanalizowanej puli fragmentów

Question 34

Sekwencjonowanie następnej generacji = NGS - analiza wyników

Answer 34

trudna i czasochłonna

Question 35

Co umożliwiają sekwenatory nowej generacji (NGS)?

Answer 35

• poznawanie nowych, nieznanych sekwencji genetycznych
• sekwencjonowanie znanych genomów w poszukiwaniu różnic oraz cech indywidualnych
• analizę aktywności genów - analizę transkryptomu
• analizę regulacji genów - analizę profilu metylacji (epigenetyka)

Question 36

Mikromacierze DNA - należą do jakiej grupy technik analizy genomu?

Answer 36

Wysokoprzepustowych

Jednoczesne badanie tysięcy genów w pojedynczym eksperymencie

Question 37

Mikromacierze DNA - jakie zjawisko wykorzystuje ta metoda?

Answer 37

Komplementarnej hybrydyzacji kwasów nukleinowych

Question 38

Mikromacierz DNA - co to?

Answer 38

Siatka tysięcy jednoniciowych sekwencji oligonukleotydowych, tzw. sond genetycznych, unieruchomionych na powierzchni specjalnego nośnika, np. szklanej płytki

Question 39

Mikromacierz DNA - skąd wiemy która sonda na powierzchni płytki?

Answer 39

Każda sonda ma określoną:

• pozycję na mikromacierzy
• sekwencję, dzięki czemu jest komplementarna do analizowanego regionu w genomie

Question 40

Mikromacierze DNA - przygotowanie materiału pacjenta

Answer 40

Wieloetapowe:

-hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie materiału genetycznego z płytką mikromacierzy

Question 41

Mikromacierze DNA - wiązanie mat. pacjenta z płytką

Answer 41

Na zasadzie parowania zasad azotowych (komplementarności) materiału badanego z sondami na mikromacierzy

Question 42

Mikromacierze DNA - otrzymywanie wyników

Answer 42

Skanowanie płytki -> obraz tysięcy pól świetlnych
Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do ilości zhybrydyzowanych sekwencji komplementarnych

->analiza cyfrowa i bioinformatyczna
Intensywność świecenia jest zamieniana na liczbę pikseli, a świecące pola na zakodowane obszary genomu

Question 43

Mikromacierze DNA - wystarczy przeanalizowanie tylko mat. pacjenta?

Answer 43

Nie, trzeba jeszcze przeanalizować materiał referencyjny

Question 44

Dwa rodzaje mikromacierzy DNA:

Answer 44

• jednokolorowe

- dwukolorowe

Question 45

Mikromacierze DNA - jednokolorowe

Answer 45

Jeden kolor znacznika fluorescencyjnego

Dwie równoległe analizy mat. badanego na jednej płytce i mat. kontrolnego na drugiej -> porównanie

Question 46

Mikromacierze DNA - dwukolorowe

Answer 46

Dwa związki fluorescencyjne
Jeden kolor dla mat. badanego, drugi dla kontrolnego
Równoczesna analiza na jednej płytce -> wypadkowa fluorescencja dwóch kolorów

Question 47

Mikromacierze cytogenetyczne = arrayCGH

Answer 47

Odpowiednik klasycznego kariotypu, ale znacznie większa rozdzielczość

Question 48

Mikromacierze SNP

Answer 48

Detekcja zmienności w liczbie kopii (DELECJI, DUPLIKACJI)

Detekcja UPD i LOH (DISOMIA JEDNORODZICIELSKA i UTRATA HETEROZYGOTYCZNOŚCI)

Question 49

Mikromacierze oceniające nieprawidłowości na poziomie DNA umożliwiają identyfikację jedynie zmian o charakterze…

Answer 49

niezrównoważonym

Question 50

Złoty standard wykrywania drobnych zmian w strukturze DNA

Answer 50

jeden do kilkunastu nukleotydów: Sanger