T2_Diagnóstico laboratorial em Micologia ★ Flashcards
O que é a Micologia?
Estudo dos fungos
Quais fungos são exclusivamente leveduras?
- Candida spp.
- Cryptococcus spp.
Quais fungos são exclusivamente bolores?
Oportunistas
Aspergillus spp. (septados com conídos - cabeça aspergilar)
Mucormicoses (não septados com esporângios)
* Rhizopus spp
* Mucor spp
* Rhizomucor spp
* Lichtheimia spp.
Superficiais (todos, menos a Malassezia)
* Hortea werneckie
* Trichosporon spp.
* Piedra Hortae
Todos os cutâneos (hifas septadas)
* Microsporum
* Trichophyton
* Epidermophyton
No slide (AULA T2_Inf23/24): Geotrichum, Neoscytalidium e Onychocola
E os dimórficos podem ter a fase filamentosa (e infetante), quando expostos ao ambiente e condições adversas
Sistematização de fungos
Como podemos dividir os bolores?
Quais são os fungos com Conídios em cacho?
- Fusarium
- Scedosporium
- Sarocladium (ex.: Acremonium)
Quais são os fungos com Conídios em cadeia?
- Penicillium
- Verticillium
- Purpureocillium
- Paecilomyces
- Rasamsonia
Caracteriza o diagnóstico de Infeções fúngicas em doentes oncológicos
O diagnóstico das IFI no doente oncológico passa pelos mesmos tipos de testes do doente não oncológico…
No entanto, existem algumas particularidades em relação a alguns testes que têm valor diagnóstico diferente… E porquê?:
Por um lado, ao facto de certos doentes oncológicos apresentarem neutropenias acentuadas, pelo que estes doentes terão maior carga fúngica e maior probabilidade de disseminação
Por outro lado, nalguns destes doentes está recomendada profilaxia antifúngica e quando esses antifúngicos são anti-bolores, o valor dos testes para detectar bolores também se altera
Qual é o exame que COMPROVA a existência de fungos? Tem limitações?
O exame histopatológico é aquele em que vemos o fungo dentro dum tecido e vemos a respectiva reacção tecidular. E isto é o ideal porque é um diagnóstico COMPROVADO (desde que seja dum local normalmente estéril) Ou seja, não há dúvida que a causa é um fungo. E isto em qq doente.
Agora há um problema: NÃO DIZ QUAL É O FUNGO
Qual é a amostra ideal para o exame histopatológico de uma infeção fúngica?
Amostra do tecido infetado, à partida com uma reação inflamatória concomitante. - Biópsia é o ideal
Obtens um único exame cultural positivo, no qual cresceram fungos, qual é a conclusão que tiras?
Quando nós isolamos um fungo em cultura (quando semeamos uma amostra de um doente e recuperamos um fungo em cultura), se nós só tivermos esse teste positivo nós nunca poderemos garantir que esse fungo não foi apenas um fungo que contaminou a placa, ou não foi o fungo que no processo de colheita quando nós abrimos o recipiente para colocar a nossa amostra não tenha caído um esporo que depois foi semeado juntamente com a amostra e que veio a revelar um teste positivo.
Portanto não podemos excluir uma contaminação em qualquer fase do processo. Isto se apenas o exame cultural for positivo.
Mas quando eu vejo ao microscópio um fungo dentro de um tecido com uma reação inflamatória de resposta a esta invasão eu tenho a certeza que essa infecção é causada pelo fungo porque eu estou a vê-lo dentro do tecido.
Nas situações em que os fungos colonizantes estão a superfície das nossas estruturas cutâneas ou mucosas e não estão dentro do tecido, não invadem. Invadir é um sinónimo de doença invasiva, portanto verificar por microscopia essa invasão dá-me um comprovativo inequívoco da origem micológica. Estas amostras nem sempre são possíveis de colher porque muitas vezes os doentes têm situações clínicas muito graves em que há uma grande debilidade, défice de plaquetas… e não é possível fazer este tipo de testes, e portanto nós nem sempre conseguimos ter esta amostra tão privilegiada que é uma biópsia.
As vantagens deste exame histopatológico é dizerem-nos com segurança que aquela infecção é fúngica.
Quais os mecanismos patogénicos dos fungos
- Colonização e doença - o fungo está no nosso organismo, isto é, coloniza-nos e depois multiplica-se e causa doença.
- Micotoxicoses - fungos produtores de toxinas; são as toxinas que, ao ser ingeridas, causam doença.
Ex: amatoxina (amanita phalloides), alcaloides do centeio (Claviceps purpúrea) - Hipersensibilidade
As infeções fúngicas são geralmente infeções _______ que vão aparecer, normalmente, em doentes _______.
oportunistas
imunocomprometidos
Quais as patologias associadas aos fungos?
HIV/SIDA:
* Pneumonia por Pneumocistis jiroveci
* Meningoencefalite por Cryptococcus neoformans
* Histoplasmose causada pelo Histoplasma
Doença pulmonar:
* DPOC e ASMA - Aspergillus → aspergilose broncopulmonar alérgica e aspergilose pulmonar crónica
* Tuberculose (nas “cavernas tuberculosas”) – Aspergillus
Neoplasias
* Aspergilose invasiva por Aspergillus
* Candidíase invasiva por Candida Albicans
Quais as características gerais dos fungos?
4
- Células eucarióticas, heterotróficas
- Parede celular com quitina
- Membrana celular com ergosterol
- Têm dois tipos de reprodução – sexuada e assexuada; o mais frequente é a reprodução assexuada.
Qual a morfologia das leveduras?
3
- unicelulares
- redondos ou ovais
- gram + (coloram com Gram)
Qual a morfologia dos bolores/fungos filamentosos? (5)
- pluricelulares
- constituídos por hifas (Nota: hifas é nome que se dá aos filamentos)
- ao conjunto de hifas dá-se o nome de micélio
- as hifas podem ser septadas ou não septadas/cenocítica (mucormicetes)
- produzem esporos em condições adversas.
Qual a morfologia dos dimorfos?
Transitam de uma forma para a outra dependendo das condições de crescimento (variam em função da temperatura, CO2 e outros fatores…).
- Em meios ricos → forma de levedura – ex: no homem
- Em meios pobres → forma filamentosa – ex: na natureza, em temp. ambiente.
Como é que os fungos dimorfos são adquiridos?
No meio ambiente por inalação na sua forma filamentosa; no corpo humano vão alterar para levedura e é nessa forma que vão depois causar patologia
Filamentoso = infecioso
Levedura = patogénico
Como é a reprodução das leveduras?
Assexuada
Gemulação: A célula mãe emite um prolongamento que dará origem à célula filha.
ou
Clamidosporos: são estruturas de resistência, constituídas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhantes aos esporos.
O que são pseudo-hifas?
Na gemulação, a nova célula não se separa, dando origem a uma gémula alongada (estrangulada na zona do septo)
Como se distinguem as hifas das pseudo-hifas?
▪ Nas hifas os lados são paralelos, enquanto que nas pseudo-hifas não.
▪ As pseudo-hifas são estranguladas na zonas dos septos.
Como é a reprodução dos bolores?
Podem ter:
Esporos sexuados: resultam da fusão de 2 gâmetas
ou
Esporos assexuados:
* Esporangiosporos (fungo não septado): quando produzidos dentro de uma estrutura sacular
* Conídios (fungo septado): quando livres
Extensão da hifa: reprodução sexuada; fusão de hifas de dois micélios diferentes
Qual é a particularidade dos esporos?
Só são produzidos em condições adversas.
Para identificar bolores temos de cultivar em meios pobres para induzir a formação de esporos, pois cada bolor tem um tipo de esporos caraterístico que nos vai permitir fazer a identificação
Como é que os bolores são adquiridos?
São adquiridos geralmente no meio ambiente por inalação de esporos; no corpo humano encontram-se na forma filamentosa
Infecioso = esporo
Patogénico = filamentoso
Quais são os tipos de amostras utilizadas no diagnóstico fúngico? Quais é que são as amostras específicas para a micologia?
4 + 3
Sangue, LCR, urina, biópsia
Específico = unha, cabelo, escama cutânea (colhe-se à periferia porque é a zona mais ativa)
Como é que se colhe a unha para amostra fúngica?
- Fazer limpeza prévia das unhas, escovando com água e sabão.
- Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha
- Com lâmina de bisturi, raspar as áreas mais profundas e pulverulentas
- Colocar este material entre lâminas e vedá-las com fita adesiva.
Os fungos crescem em anaerobiose ou aerobiose?
Aerobiose (nunca em anaerobiose)
Quais são os tipos de exame direto que podemos usar em micologia?
- A Fresco
- Hidróxido de potássio (KOH)
- Tinta da China (Método de Burri)
Podemos ainda usar Gram
Como é feito o exame de hidróxido de potássio? Para que amostras?
Usa-se em amostras de grande celularidade (unha, escama, cabelo, biópsia)
Cobre-se a amostra com KOH (hidróxido de potássio) e este vai dissolver a queratina, obtendo-se assim uma amostra mais fina, facilitando a visualização das estruturas do fungo.
Como é feito o exame de tinta da china? Para que amostras?
Usa-se no LCR, urina ou sangue
Numa lâmina coloca-se 1 gota amostra + 1 gota tinta China, e cobre-se com a lamela
A tinta da china vai corar o LCR (ou outra amostra) de preto, permitindo destacar a cápsula do Cryptococcus.
Como é feito o exame do método de Burri?
Basicamente igual à tinta da china (1 gota da amostra + 1 gota do corante), mas depois faz-se coloração com roxo de metileno, que vai corar os Cryptococcus, destacado-os mais.
Quais são os exames importantes para a meningite fúngica?
Cryptococcus: tinta da china e método de Burri
Hoje em dia faz-se teste de pesquisa de antigénio, que são mais fiáveis, portanto estas técnicas estão a perder alguma importância.
Qual é o meio utilizado para o exame cultural fúngico?
Meio de Sabouraud
Se amostras tiverem flora saprófita: Gelose Sabouraud Cloranfenicol-Gentamicina (tem antibiótico para inibir a maioria das bactérias gram + ou -)
A que temperatura crescem os fungos?
30ºC - Crescem a maioria dos fungos saprófitas e patogénicos
37ºC - Crescem a maioria dos fungos patogénicos; não crescem os fungos saprófitas
Quais são a patologias associadas a candida?
8
- Candidíase oral e esofágica,
- vaginite,
- cistite,
- endocardite,
- meningite,
- bacteriémia,
- doença disseminada
Quais são as patologias associadas ao Cryptococcus?
4
- Meningo-encefalite,
- Infeção pulmonar,
- Doença disseminada envolvendo a pele,
- Lesão no osso e articulações
Como é que se faz a identificação das leveduras?
1º deteção em exame direto com KOH, tinta da china, e coloração de Gram
2º cultura em Sabouraud (24-72h)
3º identificação definitiva com testes bioquímicos e prova de filamentaçao precoce (Candida albicans)
Como é que se faz a prova da filamentação precoce? O que é uma prova positiva?
Colónia de levedura em suspensão em soro bovino fetal
Incubar 3h (máximo) a 37ºC
Colocar 1 gota entre lâmina e lamela e observar ao microscópio 40x
* + = forma-se filamento sem constrição na base (C. albicans)
* - = filamentos com constrição ou não se formam filamentos ou filamentos sem constrição depois de 3h
Quais são as diferenças entre Candida e Cryptococcus, importantes para o diagnóstico laboratorial?
Candida
* cheiro a fermento de padeiro
* não tem cápsula
* urease -
* Prova de filamentação + = C. albincans
Cryptococcus
* tem cápsula
* urease +
No diagnóstico em Micologia quando se faz o TSA?
- situações pontuais em que o doente não está a responder à terapêutica dirigida - sendo esta a proposta pelas guidelines (podemos antecipar ou suspeitar que ele de uma mutação, adquirindo resistência ao fármaco)
- Deteção de um fungo raro, não tendo bibliografia suficiente a sustentar a terapêutica
- Vigilância epidemiológica
Qual a Candida associada a surtos hospitalares?
Auris - resistência a todos os antibióticos
Qual a divisão da patologia dos bolores? Consoante o tipo de hifas
Hifas septadas
* hialohifomicoses (não tem melanina e são hialinas)
* feohifomicoses (tem melanina e são pretas)
Hifas não septadas = mucormicoses (zigomicoses)
Quais são os géneros das hialohifomicoses?
- Aspergillus,
- Fusarium,
- Scopulariopsis,
- Phaecilomyces
Quais são os géneros das feohifomicoses?
- Alternaria,
- Ulocladium,
- Sporothrix,
- Exophiala
Quais são os géneros das mucormicoses?
- Mucor,
- Rhizopus,
- Rhizomucor,
- Absidia
Na micologia o Gram colora ______
Leveduras!
Qual destas técnicas tem maior sensibilidade na micologia?
1. Microscopia ótica, ou
2. Microscopia de fluorescência
2_Microscopia de fluorescência
Estas técnicas de coloração para visualização em microscopia óptica têm uma sensibilidade muito baixa, portanto só conseguimos detectar estruturas fúngicas quando a invasão é grande, quando a carga fúngica nos tecidos é muito grande.
Uma forma de eu conseguir melhorar a sensibilidade destes exames microscópicos é utilizar a microscopia de fluorescência, em que eu consigo (através de um corante que emite fluorescência) corar a estrutura fúngica, e utilizando um microscópio de fluorescência eu consigo ver essas estruturas que são muito brilhantes em relação a um fundo escuro e eu consigo ver com uma pequena ampliação uma zona de campo muito grande, portanto consigo ver e andar à procura numa área grande da minha amostra.
Por isso as observações por microscopia de fluorescência têm maior sensibilidade do que aquelas que são a pesquisa por coloração em microscopia simples.
Qual é o exame gold standart do diagnóstico de bolores em micologia? Há exceções?
Identificação morfológica - através de um exame cultural de amostra estéril (devemos sempre executá-lo
Nas infeções graves, nas infeções fúngicas invasivas, a identificação não deve ser apenas por morfologia, mas deve depois ser confirmada por biologia molecular, para que o nome seja certo, para que não haja dúvida nem no género nem na espécie, porque com o nome certo nós sabemos escolher o antifúngico.
Exame cultural de fungos
Fungo ⬌ tempo de incubação
Candida ⬌ _______
Cryptococcus ⬌ _______
Aspergillus ⬌ _______
_______ ⬌ 5 dias
Dermatófitos ⬌ _______
Alguns fungos _______ podem demorar meses até crescer.
Fungo ⬌ tempo de incubação
Candida ⬌ 24/48 horas
Cryptococcus ⬌ 2 ou 3 dias
Aspergillus ⬌ 5 dias
Mucormicetes ⬌ 5 dias
Dermatófitos ⬌ 2 a 3 semanas
Alguns fungos dimórficos podem demorar meses até crescer.
Como é que se faz a identificação dos bolores?
1º deteção em exame direto com KOH
2º cultura em Sabouraud (rapidez de crescimento & características das colónias)
3º identificação por morfologia microscópica
Quais as texturas verificadas nos bolores na cultura de Sabouraud?
Algodonosa = micélio tem abundantes hifas que dão aspeto de algodão
Aveludada = limitado crescimento das hifas ficando com aspeto de veludo
Pulverulenta = aspeto granulado devido à grande produção de conídios
Glabra = superfície lisa ou com aspeto de camurça
Quais as técnicas usadas na identificação por morfologia microscópica?
Técnica da fita-cola e geralmente usa-se corante azul de lactofenol para facilitar a visualização
Como se identificam os diferentes tipos de Aspergillus?
- Pela cor da colónia → macroscopicamente
- Pela cabeça – cabeça aspergilar → microscopicamente
Qual a característica específica da Aspergillus nidulans?
Tem o conidióforo (tipo o stem) castanho porque tem melanina
Qual a importância de haver outros métodos laboratoriais para diagnóstico de fungos? Quais são?
Métodos convencionais demoram muito tempo, piorando o prognóstico. Isto é especialmente grave nos imunocomprometidos.
Deteção de Ag
Quais os Ag associados aos fungos?
Candida - 1,3-Beta-glucano
Pneumocisits jirovecii - 1,3-Beta-glucano
Cryptococcus neoformans – capsular polysaccharide
Aspergillus - galactomannan
O que são espécies crípticas? Porquê que é importante conhecê-las?
São espécies que são exatamente iguais morfologicamente, mas que geneticamente são diferentes, portanto, só utilizando uma técnica de biologia molecular é que eu as consigo distinguir umas das outras.
E qual é a necessidade? É que em algumas situações as espécies crípticas têm sensibilidades aos
antifúngicos diferentes daquilo que é o esperado.
Por exemplo, o Aspergillus fumigatus é um complexo, ou seja, é um conjunto de espécies crípticas. Dentro dessas espécies crípticas, há um ou outro que se trata com um fármaco diferente do Aspergillus fumigatus, fumigatus mesmo, que é o sensu stricto. Portanto, para tratar doenças graves (doente imunocomprometido, infeção fúngica invasiva) nós precisamos de caracterizar por biologia molecular o fungo, identificá-lo para saber exatamente qual o fármaco a usar.
Quais são as desvantagens do método cultural, em micologia?
- Baixa sensibilidade. Portanto, eu só consigo ter uma cultura positiva, só consigo recuperar um fungo em 20-60% dos casos e depende do fungo em questão
- teste demorado
- nunca poderemos descartar com segurança o facto de se tratar de uma colonização ou de uma contaminação
- Necessidade de colheita invasiva (LBA, biópsia)
- UM TESTE POSITIVO SÓ ACONTECE NUMA FASE TARDIA DA DOENÇA
O Galactomannan é um bio marcador de ______
Aspergilose
Que diferentes valores diagnósticos devemos dar ao Galactomannan consoante o local de colheita e ao contexto clínico?
No soro/plasma:
* Screening no doente neutropénico com FR (determinações seriadas)
* Diagnóstico no doente neutropénico
* Permite avaliar o sucesso da terapêutica AF nos neutropénicos
LBA, LCR (nos cut-offs adequados):
* Diagnóstico (+) por IFI, caso esteja presente
Falsos positivos:
* Pip/taz (problema de lotes)
* Outros B-lactâmicos
* Bifidobacterium (crianças)
* Reacções cruzadas
Fusarium
Trichosporon
Rasamsonia
Penicillium
Histoplasma
Blastomyces
O (1,3)-β-D Glucano é um biomarcador ______
panfúngico
Polissacarídeo presente na parede de vários fungos patogénicos
O (1,3)-β-D Glucano está caracteristicamente ausente nas infeções por:
- Cryptococcus
- Mucormicetes
- Blastomyces dermatitidis
Qual é o valor diagnóstico do (1,3)-β-D Glucano?
Ele não tem um valor diagnostico, não permite fazer o diagnostico da infeção a, b ou c, mas o principal do valor dele é que quando este teste é negativo quase exclui uma infeção fúngica.
Porquê quase? Pois alguns fungos não têm este (1,3)-β-D Glucano, portanto quando o teste é negativo das duas uma: ou não há infeção fúngica ou há infeção fúngica por quem não tem o (1,3)-β-D Glucano.
O teste de Mannan - anti-Mannan é passível de se utilizar (apesar de ningém o realizar) no diagnóstico de _______
Candidíase invasiva
CrAg = _________
Antigénio do Cryptococcus
O CrAg é muito utilizado no diagnóstico de
Criptococose
Diagnóstico de Criptococose
O teste do CrAg é ________ utilizado. - CrAg (LFA ImmyTM)
* Detecta ________ e ________
* Deteção no ________: antecede sintomas ________ em ________ dias
* Monitorização terapêutica: ________
* Títulos ________ após infecção (diagnóstico inicial)
* Doente não imunocomprometido: Ag no soro geralmente ________
Pode ser detetado:
1. ________
2. ________
3. ________
4. ________
5. ________
O teste do CrAg é muito utilizado. - CrAg (LFA ImmyTM)
* Detecta C. neoformans e C. gattii
* Deteção no Soro: antecede sintomas meningite em 22 dias
* Monitorização terapêutica: sim no LCR
* Títulos permanecem após infecção (diagnóstico inicial)
* Doente não imunocomprometido: Ag no soro geralmente negativo
Pode ser detetado:
1. Soro
2. LCR
3. LBA
4. urina
5. sangue total (fingerstick)
As técnicas de biologia molecular em micologia têm de ser efetuadas em amostras _______ ou _______
Onde já se tenha observado a presença efetiva de fungo! ou que já tenham sido cultivadas a partir de amostras estéreis
Porque se não se vê uma estrutura fúngica no tecido significa que provavelmente pode lá estar qualquer pequena partícula fúngica, mas em tão pequena quantidade que nem a biologia molecular terá sensibilidade para detetar. Por outro lado, uma vez que estes fungos também são fungos do ambiente, em todo o processo de colheita e de manipulação qualquer contaminação durante o processo pode levar a um teste por biologia molecular positivo que será um falso positivo.
Portanto aquilo que é adequado é fazer biologia molecular a partir de uma amostra que é positiva onde se veem estruturas fúngicas. A outra aplicação da biologia molecular é a partir das culturas positivas, portanto para identificação, para melhor caracterização e identificação do fungo por biologia molecular e assim temos também uma identificação que permite identificar as espécies crípticas e nas infeções fúngicas invasivas a identificação deve ser não só por morfologia, mas deve avançar para confirmação por biologia molecular também.
Em que situações é importante o auxílio de técnicas de biologia molecular em micologia?
- identificar as espécies crípticas
- infeções fúngicas invasivas
nas quais a identificação deve ser não só por morfologia
Diagnóstico de infeção fúngica - critérios EORTC/MSG 2020
Quais são os 3 tipos de diagnóstico por estes critérios?
- IFI comprovada
- IFI provável
- IFI possível
Diagnóstico de infeção fúngica - critérios EORTC/MSG 2020
O quê que comprova a existência de Infeção fúngica de acordo com os critérios?
HISTOPATOLOGIA POSITIVA
ou
Cultura positiva de amostra estéril
Diagnóstico de infeção fúngica - critérios EORTC/MSG 2020
Quando não temos os critérios possíveis para um diagnóstico comprovado, como se dá o diagnóstico provável?
Quando não é comprovado (nem histopatologia nem cultura de local estéril positiva), passo a ter em conta:
Fator do hospedeiro (fatores de risco para ter doença fúngica)
+
Critério clínico (SINTOMATOLOGIA)
+
Critério micológico (TESTES INDIRETOS POSITIVOS)
Diagnóstico de infeção fúngica - critérios EORTC/MSG 2020
Quando não temos os critérios necessários para um diagnóstico comprovado, nem foram efetuados testes indiretos, como podemos caracterizar o diagnóstico de infeção fúngica?
DIAGNÓSTICO POSSÍVEL
Fator hospedeiro (de risco)
+
Critério clínico (sintomatologia)
Sem a obtenção de histopatologia positiva, nem cultura de local estéril - necessários para a COMPROVAÇÃO, nem um teste indireto positivo, não poodemos dar o diagnóstico como provável, não podendo tão pouco excluí-lo, é, apenas, POSSÍVEL
Quais são os cut-offs diagnósticos do Galactomannan, na população em geral?
Quais são os cut-offs de screening do Galactomannan, no doente neutropénico?
Num imunocomprometido podemos usar PCR no diagnóstico de aspergilose? Se sim, há critérios
Sim
Positivo em pelo menos 2 amostras seguidas de soro e/ou LBA
