T1_Diagnóstico em Microbiologia Clínica ★ Flashcards
Quais são as principais funções dum laboratório em Microbiologia Clínica?
DIAGNÓSTICO
* Confirmação de uma hipótese diagnóstica
ORIENTAÇÃO TERAPÊUTICA
* Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA)
* Deteção de mecanismos de resistência
VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA
Quais são os AB de reserva?
- CEFALOSPORINAS de 3ª geração
- FLUOROQUINOLONAS
- CARBAPENEMOS
O que são microorganismos problema? Quais são?
Isolados a partir de amostras invasivas, com necessidade de efetuar um relatório, quando o isolamento é feito em amostras estéreis - Hemoculturas e LCR
- Pseudomonas aeruginosa
- Acinetobacter spp.
- Enterobacteriaceae
- Staphylococcus aureus
- Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium
- Streptococcus pneumoniae
Quando estes microrganismos são isolados nestas amostras, são incluídos no relatório eenviados para a DGS que elabora um relatório do panorama nacional. Além destas bactérias deorigem invasiva temos uma outra que não é de origem invasiva que representa um problema nas unidades de saúde, sendo por isso também reportada para as instituições nacionais: Clostridium difficile
O que são microorganismos de alerta?
Perigosos no que toca à disseminação porque têm mecanismos de resistência
- Staphylococcus aureus com resistência à vancomicina (VRSA)
- Staphylococcus aureus com resistência ao linezolide
- Staphylococcus aureus com resistência à daptomicina
- Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis com resistência ao linezolide
- Enterobacteriaceae com suscetibilidade intermédia ou resistência aos carbapenemes e\ou presumíveis produtoras de carbapenemases
- Pseudomonas aeruginosa com resistência à colistina
- Acinetobacter spp. com resistência à colistina
Na Europa quais são os países com maiores problemas associados com a Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenemes?
Europa de Leste + Sul (Itália e países bálticos)
Quais são as 3 fases do diagnóstico no laboratório?
- Pre analítica
- Analítica
- Pós analítica
O que acontece na fase pré analítica?
- Colheita
- Acondicionamento
- Transporte da amostra
fase crucial na qualidade do resultado final, uma vez que uma amostra colhida fora do período de infeção ou não respeitando as características das regras de recolha adequadas ou mal transportada porque vem a uma temperatura ou meio de transporte inadequado – tudo isto são fatores que vão condicionar a resposta.
A capacidade de deteção laboratorial do microorganismo depende principalmente do quê?
Fatores pré analíticos
Erros na fase pré analítica geram _____.
Para evitá-los há que ter em conta:
1. _____
2. _____
3. _____
4. _____
5. _____
6. _____
7. _____
falsos positivos e falsos negativos
Para evitá-los há que ter em conta:
* Tempo em que a colheita é feita
* Local
* Quantidade
* Timing
* Recipiente
* Condições de transporte (temperatura p.e.)
* Preservação
O que acontece na fase pós analítica?
- Clínico recebe o resultado
- integra-o na hipótese inicial
- verifica compatibilidade
O quê que prevalece no processo diagnóstico, aquando da análise de uma amostra laboratorial?
A validação do clínico de acordo com a integração dos dados que lhe são fornecidos, pelo laboratório, com a história do doente que tem à sua frente. Ter noção se faz sentido ou não.
O que pode acontecer na fase analítica? Incluir testes
Amostra é processada no Laboratório. Pode ser:
1. Pesquisa dos microrganismos: por exame cultural ou observação direta
2. Serologia (Ac e Ag)
3. Diagnóstico Molecular (genes)
Qual é o exame de diagnóstico mais frequente num laboratório de Mb Clínica?
Cultural
Quais são os passos do exame cultural?
• Observação macroscópica da amostra
• Exame Microscópico direto
• Exame cultural (onde se obtêm colónias)
• Identificação e TSA (a partir das colónias obtidas no exame cultural)
Como é que se pode observar o exame direto?
Através de:
* Microscopia ótica
- de campo claro (mais frequente)
- de campo escuro
- de contraste de fase
* Microscopia de fluorescência
* Microscopia eletrónica (raramente utilizada no laboratório clínico)
O que é um exame direto a fresco? Qual é a desvantagem?
Sem coloração + líquido
Os exames a fresco fazem-se com amostras líquidas e estas são observadas entre lâmina e lamela:
* Sem nenhuma coloração (de contraste) = a fresco ou,
* KOH
* Azul de Lactofenol
* Iodo
* Tinta da China
Menor ampliação (400x a freco vs 1000x corado)
Para as bactérias, um exame a fresco, permite apenas ver __ ____ _____ ou _____, quando _____, se são _____ ou _____.
Estruturas _____, passíveis de serem observadas no exame a fresco, incluem-se:
* _____
* _____
* _____
Para as bactérias, um exame a fresco, permite apenas ver se estão presentes ou ausentes, quando presentes, se são móveis ou imóveis.
Estruturas maiores, passíveis de serem observadas no exame a fresco, incluem-se:
* Células (epiteliais, por exemplo)
* Fungos
* Parasitas
O exame corado faz-se com uma amostra líquida? Quais são os mais usados no laboratório?
Não.
Os corados já não são de amostras líquidas. Nestes vamos secar a amostra (fazer um esfregaço).
A vantagem é que podemos aplicar corantes robustos que nos permitem observar com grande ampliação (porque as estruturas têm cor, e conseguimos aplicar mais luz para a grande ampliação).
Os mais usados são o Gram e o Ziehl-Neelsen (dirigido para bacilos álcool ácido resistentes, dos quais o principal representante é o agente da tuberculose – Mycobacterium Tuberculosis).
Descreve o procedimento de utilização da coloração Gram
- As bactérias, inicialmente, estão descoradas no esfregaço
- São coradas com violeta de cristal
- Aplicada solução iodada, que melhora fixação do corante
- Descoloração com etanol: vai penetrar nas bactérias de parede frágil e remover o primeiro corante. As de estrutura de parede robusta que têm muito péptido-glicano, não permitem que moléculas do corante saiam e permanecem roxas
- Aplica-se um corante de contraste , mais claro, a safranina, e as bactérias que perderam o primeiro corante, coram com o segundo (de rosa)
As Gram positivas são as roxas e as Gram negativas são rosadas.
Na coloração Gram, as bactérias Gram + são ____ e as Gram - são ____
Na coloração Gram, as bactérias Gram + são as roxas e as Gram - são rosadas.
Quais são os cocos Gram +?
- Staphylococcus
- Streptococcus
- Enterococcus
Quais são os bacilos Gram +?
- Bacillus
- Listeria
- Erysipelothrix
- Corynebacterium
- Nocardia
- Mycobacterium
Quais são os cocos Gram -?
- Neisseria
- Moraxella
Quais são os bacilos/coco bacilos Gram -?
- Enterobacteriacae
- Vibrio
- Aeromonas
- Campylobacter
- Helicobacter
- Pseudomonas
- Acetinobacter
- Haemophilus
- Bordetella
- Brucella
- Legionella
Onde posso encontrar meios sólidos de cultura?
- Placa de Petri
- Tubo
Na generalidade usamos as placas de Petri, onde é mais fácil espalhar a amostra e ter colónias isoladas.
Quando é que se utiliza meios sólidos em tubo?
- Demora muito tempo a crescer logo necessário incubar
- Poder patogénico elevado (ex. Neisseria meningitidis) logo minimizar probabilidade de contaminação para quem está a manipular
Para que é que servem os meios líquidos?
As bactérias crescem muito melhor em meios líquidos do que em meios sólidos, são mais rápidas a crescer.
- amostras em que há uma pequena quantidade de microrganismos
- situações clínicas graves, onde o diagnóstico precoce é fundamental.
Um exemplo típico são as hemoculturas, os doentes em sépsis devem ter um diagnóstico microbiológico muito rápido (<12h), questiona-se em menos de 3h e as amostras são imediatamente inoculadas em meio líquido para que as bactérias se desenvolvam rapidamente.
Distingue os meios de cultura em:
* Seletivos
* Seletivos e Identificadores
* Especiais
- Seletivos - Alguns meios podem ter adicionados alguns suplementos que lhes conferem propriedades especificas. Inibem o crescimento de determinada espécie, ou promovem o crescimento de um grupo de espécies
-
Seletivos e Identificadores - Além de seletivos podem também ter um indicador, ou seja, selecionam determinado tipo de microrganismos. Por exemplo no MacConkey, é um meio de cultura em que crescem as Enterobactereaceae e há um identificador para identificar a fermentação da
lactose, e os que fermentam a lactose apresentam uma cor rosada, e os que não fermentam a lactose mantém-se da cor do meio. - Especiais - Depois, existem meios de cultura especiais, que são dirigidos para pesquisar um microrganismo específico. É o caso, por exemplo, deste meio, o BCYE que é específico para pesquisa de Legionella
Que testes podem ser utilizados para identificação do microorganismo?
Manuais
- Rápidos em que só é pesquisado p.e. apenas uma enzima
- Galerias comerciais, conjunto de testes manuais standerizados
Geralmente permitem-nos distinguir entre, ou duas famílias, por exemplo, a oxidase permite distinguir as Enterobacteriaceae das Pseudomonas
Automatizados
- Bioquímicas:
* A proteómica (Maldi-TOF), que é a técnica de espectrometria de massa, muito divulgada hoje em dia;
* A genómica, portanto, a identificação dos microrganismos por estudo da sua sequência genómica.
Como é que funciona o MALDI TOF?
- Uma pequena porção da colónia é colocada numa lâmina
- Coberta por uma matriz
- Raios laser = que vão fazer a imunização das várias partículas -> volatilizá-las e essas partículas vão voar num tubo ionizado
- Vão sendo detetadas à saída e à chegada o que permite calcular o tempo de voo = velocidade que atravessa tubo
- Velocidades criam espetro de massa
- O espetro é omparado com base de dados
Qual é a limitação do MALDITOF?
Só faz identificação. Não permite fazer TSA.
Quais são os testes de suscetibilidade antimicrobianos (TSA)?
Manuais
- Difusão (Kirby Bauer & Etest)
- Diluição
Automatizadas
- Diluição (Vitek & WalkAway)
- Genes de resistência (GenXpert& & BD Max)
- Técnicas de difusão:
O antibiótico está impregnado num disco. São discos de papel impregnados com antibiótico.
Quando colocados na placa, o antibiótico vai difundir e vai inibir o crescimento bacteriano na zona onde está presente, no caso de a bactéria ser suscetível (exemplificado no teste da esquerda). Há várias metodologias para aplicar testes de difusão. São as técnicas de difusão Kirby Bauer ou o Etest (à direita). - Técnica de diluição:
As técnicas de diluição são diferentes porque o antibiótico não está num papel para se difundir na placa de Petri, mas está diluído num tubo ou num poço destas placas.
Portanto, as técnicas de diluição se forem feitas nestas placas chama-se técnicas de microdiluição em caldo (em baixo), se forem feitas em tubo clássico (alto) são técnicas de macrodiluição.
Quanto tempo demoram os testes de suscetibilidade antimicrobianos (TSA), com e sem MALDITOF?
Sempre 48h (desde chegada ao lab).
O MALDITOF só vai influenciar a identificação mais rápida da espécie (24h VS 48h), mas o TSA vai estar sempre dependente do crescimento das culturas.
Em relação ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos, como classificamos a relação/eficácia?
- Sensível;
- Sensível com elevada exposição ou
- Resistente.
Entre um e outro fica uma outra categoria, que é o sensível com elevada exposição, isto significa que os antibióticos nem sempre são administrados com a mesma dose, e há microrganismos para os quais a dose standard é eficaz, mas há outros microrganismos ou outros locais de infeção em que precisamos de atuar com uma dose mais elevada do fármaco para conseguirmos ter o mesmo sucesso terapêutico. Quando esta situação acontece nós dizemos que o microrganismo é sensível com elevada exposição, ou seja, haverá sucesso terapêutico desde que eu administre ou desde que o microrganismo esteja sujeito a uma grande
exposição ao fármaco.
Quanto ao TSA, a letra I, da nomenculatura S, I e R, significa o quê?
Microrganismo Sensível ao fármaco com elevada exposição
Quanto ao TSA, a letra S, da nomenculatura S, I e R, significa o quê?
Microrganismo Sensível ao fármaco com a dose normal de exposição
Quanto ao TSA, a letra R, da nomenculatura S, I e R, significa o quê?
Microrganismo Resistente
O que é a Concentração Inibitória Mínima?
É a concentração mais baixa de antibiótico que permite inibir o crescimento do microorganismo
Quais são as vantagens do exame cultural?
- TSA
- Estudos epidemiológicos
- Deteta microorganismos simultaneamente
- Barato
Quais são as desvantagens de exame cultural?
- Necessita de microorganismo viável
- Demorado
- Negativo se tomado AB previamente
- Algumas bactérias não crescem nos meios de cultura
O que precisamos na serologia para determinar que estamos na fase aguda?
Ac (IgG) aumentam 4x entre as 2 semanas
Então, em serologia faço sempre duas determinações e aquilo que me faz o diagnóstico é a seroconversão, ou seja, os meus anticorpos passam de um valor negativo para um valor positivo, isso é uma seroconversão e significa uma fase aguda ou os meus anticorpos sobem 4x o valor inicial na segunda determinação em relação à primeira.
A 2ª determinação é efetuada 2 semanas depois da 1ª, e é necessário que haja um aumento em 4x para que seja possível distinguir se os meus anticorpos estão a subir na fase aguda de convalescença da doença ou se eles estão a decair na fase já tardia de recuperação da doença. Isto implica que o diagnóstico serológico é um diagnóstico tardio.
Como é que é uma reação em serologia? Como é que se faz uma titulação?
Um indivíduo colhe soro e tem anticorpos no soro.
Como é que se determina a quantidade de anticorpos?
Fazem-se diluições seriadas da amostra. Nos quatro tubos, a quantidade de anticorpo, como diluímos sempre de 1 para 2, vai sempre se reduzindo a metade.
E depois, aos mesmos tubos, juntamos uma quantidade fixa de antigénio.
Enquanto o anticorpo estiver em concentrações elevadas, vai haver uma reação.
Quando os anticorpos estão em muito pequena concentração deixa de haveruma reação visível, isto acontece nas diluições maiores, e então aí temos uma reação negativa/não há reação
Como é que definimos qual é o título ou qual é que é a diluição?
Diluição é a última em que há reação
Título é inverso
Ex. diluição é 1:4
Título é 4
Quais são as vantagens dos testes de amplificação de ácidos nucleicos (TAAN)?
- São muitíssimo rápidos;
- Podem ser feitos a partir das amostras, sem haver a necessidade da cultura, o que torna a resposta ainda mais rápida a resposta.
- Podem ser qualitativos (portanto podem identificar o microrganismo – ex: COVID-19) ou quantitativos (carga viral – ou então além de o identificar, determinar o número de cópias que existem na amostra em estudo).
Os TAAN, para além da identificação e da quantificação das cargas virais, também permitem detetar ____ __ _____
Genes de resistência
Exemplo 1
Amostra: Exsudado de ferida cirúrgica
Cultura: Staphylococcus epidermidis
Qual seria a interpretação correta deste resultado?
Exame cultural: Negativo para bactérias potencialmente patogénicas
FLORA SAPRÓFITA
Exemplo 2
Amostra: Sangue para hemocultura
Cultura: Brucella mellitensis
Qual seria a interpretação correta deste resultado?
Identificação de microrganismo patogénico inquestionável, num fluido estéril (sangue) - tratar
Exemplo 3
Doente assintomática do sexo F, faz urocultura de “rotina” para check-up de seguro de vida
Resultado:
Escherichia coli 10^4-10^5 UFC/ml
Qual seria a interpretação correta deste resultado?
Não valorizar (baixa concentração de microrganismos em doente assintomática)
NOTA:
Não há exames de rotina na Microbiologia!
Exemplo 4
Doente do sexo M, com contacto com doente tuberculoso há um mês mas sem queixas. Pede-se pesquisa de Mycobacterium tuberculosis
Resultado:
Exame cultural: Mycobacterium tuberculosis
Qual seria a interpretação correta deste resultado?
Valorizar sempre! Faz parte dos microrganismos que devemos ter sempre em conta!
Exemplo 5
Doente do sexo M com furúnculo do antebraço, drenado mas que mantém exsudado purulento que é enviado para exame cultural
Resultado: Cultura estéril
Qual seria a interpretação correta deste resultado?
Situação tipicamente infecciosa mas sem cultura positiva:
Provável toma prévia de antimicrobianos, que inviabilizaram o crescimento dos microrganismos
Quais são os casos excecionais em que devemos valorizar uma serologia positiva, sem esperar pela seroconversão?
Legionella e HIV
