SPECTROMÉTRIE DE FLUORESCENCE MOLÉCULAIRE Flashcards
La spectrométrie de fluorescence moléculaire étudie l’émission de lumière par des molécules, en solution après excitation par des _______ appartenant au domaine du __________ ou du _____________.
photons;
visible ou du proche ultraviolet.
L’______________ est une émission de lumière chaude.
incandescence
La luminescence est une émission de rayonnements électromagnétiques visible ou proche ultraviolet avec dégagement de chaleur. (V/F)
F: sans dégagement de chaleur
Selon la source de l’énergie excitatrice, on distingue plusieurs phénomènes de luminescences:
Chimiluminescence: _____________________;
Bioluminescence: _______________________;
Thermoluminescence: __________________;
Electroluminescence: ___________________;
Photoluminescence: ____________________;
Chimiluminescence: Réaction chimique;
Bioluminescence: Réaction enzymatique;
Thermoluminescence: Radioactivité - chaleur;
Electroluminescence: Courant électrique;
Photoluminescence: Absorption de photons.
Selon la durée de la photoluminescence, on distingue : ______________ et ______________.
- La phosphorescence ; de longue durée (plusieurs minutes voir plusieurs heures);
- La fluorescence ; de courte durée (quelques nanosecondes).
La fluorimétrie regroupe deux techniques analytiques distinguées comme suit: ________________ et ________________.
Spectrométrie de fluorescence moléculaire;
Spectrométrie de fluorescence atomique ou spectrométrie de fluorescence X.
Analyte de la Spectrométrie de fluorescence moléculaire: _________.
Molécule
Domaine énergétique de la spectrométrie de fluorescence moléculaire: ______________.
Visible et proche UV
Domaine énergétique de la Spectrométrie de fluorescence atomique ou spectrométrie de fluorescence X: _________________ayant pour analyte __________.
Rayons X;
Atome.
Proche ultraviolet : ___ à ___nm;
Visible : ___ à ___ nm.
200 à 400 nm;
400 à 800 nm.
La photoluminescence résulte des énergies _____________ et ______________.
électronique et vibrationnelles
En fluorescence : Les transitions électroniques se font entre deux états énergétiques de _________________.
même multiplicité
En phosphorescence : Les transitions électroniques se font entre deux états énergétiques de ___________________.
multiplicités différentes
Chaque électron est caractérisé par les nombres quantiques : _________, __________, ___________.
- Principal « n »;
- Secondaire « l »;
- Magnétique (spin) « m » (m = ± ½).
La multiplicité M définit deux états électroniques : ___________ ou ____________.
SINGULET ou TRIPLET
M = ___________.
M = 2S + 1
S: somme des spins des électrons d’une orbitale moléculaire
Etat SINGULET : M = __;
Etat TRIPLET : M = 3__.
Etat SINGULET : M = 1
Etat TRIPLET : M = 3
On distingue ainsi les états électroniques suivants: _________________, ______________, _________________.
a. Etat électronique fondamental SINGULET : Les électrons appariés ont des spins opposés ou antiparallèles (↑↓)
M = 2 [(+ ½ ) + ( - ½ )] + 1 => M = 1;
b. Etat électronique excité SINGULET : Les électrons non appariés ont de spins opposés ou antiparallèles (↑↓)
M = 2 [(+ ½ ) + ( - ½ )] + 1 => M = 1;
c. Etat électronique excité TRIPLET : Les électrons non appariés ont de spins parallèles (↑↑)
M = 2 [(+ ½ ) + ( + ½ )] + 1 => M = 3.
Le ____________ est un schéma couramment utilisé en chimie pour représenter les différents processus photophysiques et photochimiques qui se produisent dans une molécule après l’absorption de lumière.
diagramme de Jablonski
Les états électroniques représentés par le diagramme de Jablonski: ____________, ______________, ________________.
- État fondamental (S₀);
- États excités singulets (S₁, S₂, etc.);
- États excités triplets (T₁, T₂, etc.).
Les transitions représentées dans le diagramme de Jablonski:
_____________;
__________________: ___________, ___________, _____________;
__________________: ______________, ______________________.
Excitation;
Désactivation non-radiative: Relaxation vibrationnelle, Conversion interne, Conversion inter-système;
Désactivation radiative: Désactivation directe, Désactivation après changement de multiplicité.
L’absorption d’un quantum d’énergie fournie par une source lumineuse externe permet le passage d’électrons de l’état fondamental à un état excité. (V/F)
V
Dans la désactivation non-radiative, la dissipation de l’énergie se fait sous forme de ___________.
chaleur
Dans la désactivation radiative, la dissipation de l’énergie se fait sous forme de ___________.
radiations
Relaxation vibrationnelle: Transfert de l’énergie au niveau vibrationnel le plus bas du _______________________.
même niveau énergétique excité
Conversation interne: Transfert de l’énergie du niveau vibrationnel le plus bas d’un état excité à un ______________________.
état électronique inférieur
La conversion externe implique le transfert de l’énergie au _______ ou à ___________.
Solvant ou matrice
Conversion inter-système: Changement de multiplicité nécessitant un _____________________ et évolution d’un état ___________ à un état_____________ d’énergie voisine et de durée de vie _________.
retournement de spin;
excité SINGULET S1;
excité TRIPLET T1;
plus longue.
La Désactivation directe implique une transition entre l’état _____________ et l’état __________________.
excité SINGULET S1;
fondamental SINGULET S0.
Lors d’une désactivation directe, l’énergie restituée est plus faible que l’énergie absorbée. (V/F)
V
La radiation émise lors d’une désactivation directe a une durée de vie de ___ et ___ secondes.
10-9 - 10-7
La désactivation directe est à l’origine du phénomène de la phosphorescence. (V/F)
F: Fluorescence
La Désactivation après changement de multiplicité implique le passage d’un état excité ___________ à l’état fondamental ____________.
TRIPLET T1;
SINGULET S0.
Après changement de multiplicité, la désactivation par émission de lumière est de longueur d’onde _________ que celle de la lumière initialement absorbée ou celle émise par fluorescence.
plus grande (moins énergétique)
La Désactivation après changement de multiplicité est à l’origine de la phosphorescence. (V/F)
V
La transition de l’état triplet à l’état fondamental est ___________ et donc ________ que celle de la fluorescence, ce qui explique pourquoi la phosphorescence est souvent observée sur une période plus longue et à une longueur d’onde plus grande.
moins probable;
plus lente;
La spectrométrie de fluorescence moléculaire utilise la mesure de l’intensité de __________________ par la substance à examiner par rapport à celle émise par un _____________.
lumière fluorescente émise (If);
étalon déterminé.
La fluorescence est mesurée à un angle de 90° par rapport au trajet optique du rayonnement incident (I0) afin de différencier la lumière fluorescente de la ________________.
lumière transmise (It)
Spectre d’émission de fluorescence : L’intensité de fluorescence émise est mesurée sur une plage de longueurs d’onde en excitant la molécule à _____________________.
une longueur d’onde fixe
Spectre d’excitation de fluorescence : L’intensité de fluorescence émise est mesurée sur une longueur d’onde fixe en excitant la molécule à ____________________.
des longueurs d’ondes variées.
Dans un milieu optiquement transparent, le spectre d’émission est une _______________ du spectre d’excitation.
image inversée (effet miroir)
En général, lorsqu’une molécule absorbe de la lumière, elle le fait à une longueur d’onde __________ (ce qui signifie une énergie ________) que celle à laquelle elle émet de la lumière par fluorescence.
plus courte;
plus élevée.
Le ___________________ désigne la différence entre la longueur d’onde (ou la fréquence) de la lumière absorbée par une molécule et celle de la lumière qu’elle émet par fluorescence.
déplacement de Stokes (ou shift de Stokes)
Le ________________ détermine l’efficacité d’une molécule à fluorescer.
rendement quantique de fluorescence Φf
Φf = _____________________.
Φf = nombre de photons émis/nombre de photons absorbés= If/Ia
If: Intensité de fluorescence;
Ia: Intensité absorbée.
ɸf = 0 => __________________.
Absence de fluorescence
ɸf = 1 => _________________.
Fluorescence maximale
__ < ɸf < __
0 < ɸf < 1
Intensité de fluorescence « If » est égale à: If = _____________________.
If = ɸf * Ia = ɸf * (Io - It)
Io: Intensité du rayonnement incident;
It: Intensité du rayonnement transmis.
If = ɸf * (Io - It) = ________________ = _________________
ɸf * Io (1 - It/Io) = ɸf * Io (1 - 10^-A)
On ne mesure qu’une partie de la fluorescence à 90°. (V/F)
V
If = ______________________= K’ * __.
k x ɸf x I0 x (2,3.ε.l.c)
K’ * C
Le facteur K’ regroupe les paramètres propres au ________et à l’_________. En pratique, ces paramètres sont fixes.
composé;
appareillage.
La linéarité de la fonction If = f(C) n’est vérifiée que pour les solutions __________.
très diluées (< 10-4M).
L’intensité de fluorescence If dépend de : ____________, ____________, ____________, _____________, _______________.
✓ L’intensité Io de la source;
✓ L’appareillage;
✓ La longueur d’onde d’excitation;
✓ La concentration de la solution fluorescente;
✓ L’environnement, la nature du solvant, la température et le pH.
Le temps de vie radiatif (τ) est caractéristique de chaque espèce moléculaire fluorescente, il est de __ à ____ nm.
1 à 100 nm
Pour t = τ: [MS] = __________=____________.
[MS] = [MS]o/e = [MS]o/2,718
MS : Nombre de molécules excitées au temps t
MS0: Nombre de molécules initialement excitées
e = 2,718 (base des logarithmes népériens)
Plus τ est court, __________sera la fluorescence.
meilleure
La sensibilité de la spectrofluorimétrie est ______________ à τ.
inversement proportionnelle
τ varie en fonction de l’environnement : _____, ______…etc
Solvant;
pH.
Les espèces fluorescentes sont dites ______________.
FLUOROPHORES
Les fluorophores généralement des composés _______________.
organiques aromatiques
Les fluorophores répondent aux critères suivants: ____________, __________, ___________, ___________, ____________.
✓ Absorption dans le visible ou le proche ultraviolet;
✓ Coefficient d’extinction molaire εmax important;
✓ Fort rendement quantique (0.8 - 0.9)
✓ Très courte durée de vie de fluorescence (≈ ns)
✓ Grand décalage de STOKES
Un fluorophore avec un ____________ élevé est plus efficace pour convertir l’énergie lumineuse absorbée en lumière fluorescente.
rendement quantique
La fluorescence est privilégiée par les molécules: ________, ________, __________.
✓ Cycliques;
✓ Rigides;
✓ Possédant des liaisons π.
La fluorescence est augmentée par la présence de ___________________ et est diminuée par la présence de ____________________________.
groupements électrodonneurs (OH, NH2, R …);
groupements électroattracteurs (NO2, COOH, X …).
Une augmentation de la polarité, diminue ___et augmente ___________.
If;
λémission.
Phénomènes lumineux parasitaires de fluorescence: ____________, __________, _____________.
Diffusion de Rayleigh;
Diffusion Raman;
Raie du 2ème ordre.
Diffusion de Rayleigh: Diffusion à la même longueur d’onde d’une ________________.
petite fraction de la lumière excitatrice
Diffusion Raman: Diffusion d’une fraction plus petite de la lumière excitatrice à des longueurs d’onde ________ par perte de l’énergie sous forme de _________.
plus grandes;
vibrations.
Raie du 2e ordre : Positionnée à ________ la longueur d’onde maximale d’excitation, il s’agit d’un phénomène purement optique dû à la ________________________.
deux fois;
diffraction de la lumière sur les réseaux de l’appareillage.
Une augmentation de la ______________ et/ou une diminution de la __________ entrainent une accélération des mouvements browniens qui augmentent les chocs entre les molécules favorisant la ____________ce qui entraine une diminution du ______________ de fluorescence.
température;
viscosité;
relaxation non radiative;
rendement quantique.
La _______________________ décrit la diminution de l’émission de fluorescence après un temps d’excitation prolongé due à la destruction du fluorophore par la lumière excitatrice.
photo-décomposition
Le _______________ décrit la diminution du rendement quantique par transfert d’énergie.
Quenching de fluorescence
_________________________ décrit la destruction irréversible d’un fluorophore excité par la lumière en présence d’oxygène.
Photobleaching (photoblanchiment)
Si la forme acide est fluorescente, pH ↑ => [H3O+] ↓ => If __.
↓
Si la forme basique est fluorescente, pH ↑ => [H3O+] ↓ => If __.
↑
Les cuves utilisées en spectroscopie fluorescence sont en __________.
quartz
La source polychromatique est une lampe à ___________________.
arc xénon haute pression (200 à 800 nm)
Un spectre de fluorescence obtenue en 3D (trois dimensions) If = f( λémission, λexcitation) est une signature de la molécule d’où la __________ de la spectrofluorimétrie.
sélectivité
Grâce à des ___________, il est possible d’identifier les substances chimiques fluorescentes.
bases de données
La spectrofluorimétrie est ____ à ____ fois plus sensible que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible.
10 à 1000
Applications de la SFA en analyse quantitative: ___________, __________, ___________.
- Analyse directe: Mesure de la fluorescence des molécules naturellement fluorescentes (quinine et dérivés);
- Analyse fondée sur le phénomène d’inhibition : Mesure de l’atténuation de la fluorescence;
- Analyse après modification.
Il est possible d’analyser les substances chimiques non fluorescentes naturellement par: ______________, ______________, ________________.
- Modification de la structure chimique sous l’influence du pH (Aniline);
- Réaction de cyclisation (Oxydation de la vitamine B6);
- Dérivatisation de fluorescence.
L’aniline devient fluorescente à pH compris entre __ et __.
4,5 et 12
L’oxydation de la vitamine B6 par le _______________ peut rendre la vitamine B6 fluorescente.
permanganate de potassium (KMnO4)
La Dérivatisation de fluorescence implique le ____________________.
greffage sur un analyte non fluorescent un fluorophore
On utilise l’__________________comme marqueur fluorescent des acides à courte chaine.
hydroxyméthyl-9 anthracène (9HMA)
En Chromatographie sur Couche Mince CCM on utilise : _______________________ ou ____________________.
Plaque fluorescente et les taches sont détectées par atténuation de la fluorescence;
Plaque non fluorescente et les taches sont détectées par émission de fluorescence dans une chambre UV.
En HPLC, la fluorescence offre une sensibilité extrêmement élevée, avec des limites de détection pouvant atteindre l’ordre du ________________.
femtomole (10^-15 mole)
En HPLC, la fluorescence est utilisée pour le ____________________________.
dosage sérique des vitamines et des hormones
