Les méthodes électrophorétiques Flashcards
Le phénomène de déplacement d’une ___________sous l’effet d’un __________ est appelé ELECTROPHORESE (EP).
macromolécule chargée;
champ électrique.
Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur _______ et pour des ________, en fonction de leur ___.
charge;
charges identiques;
taille.
En fonction de différents paramètres: _______, ________, _______, ________, _______ la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules.
charge;
masse;
forme;
nature du support;
conditions physico-chimiques.
L’électrophorèse permet de__________________. La séparation est _____.
traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps;
fine.
Les substances ayant des groupes fonctionnels capables de s’ioniser en solution donnent naissance à des particules chargées positivement ou négativement. (V/F)
V
L’ionisation dépend de: _______________, ______________.
- Nature des composés;
- Milieu environnant: pH et la force ionique.
Pour les Ions _______, l’ionisation est simple : C’est la charge de ________ ou __________.
métalliques;
molécule ou particule solide: Q.
Les molécules ______________ présentent une ionisation complexe en raison de leur capacité à agir à la fois comme acides et bases.
organiques amphotères
Les ____________ sont de grandes molécules, comme des protéines ou des polymères, qui sont entourées par des molécules de solvant.
macromolécules solvatées
Le ______________ mesure la charge nette des macromolécules solvatées en solution.
potentiel électrocinétique
Lorsque le pH du milieu est tel que le nombre de charges positives est égal au nombre de charges négatives, la protéine possède une charge globale nulle et ne migre pas lorsqu’elle est soumise à un champ électrique, c’est le __________.
point isoélectrique (pHi).
La migration dépend de plusieurs facteurs : ____________ et _____________.
mobilité électrophorétique U;
forces de frottement f.
La mobilité électrophorétique U est fonction de la _______ et de la ________ de la particule.
charge;
géométrie.
Une particule de charge électrique Q, placée dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l’entraîne vers l’électrode de signe opposé: ____________.
F = Q * E
Des forces de frottement f, dues à la ____________, s’opposent à la migration de la particule.
viscosité du milieu ή
Loi de Stokes: ______________.
f = 6Π * η * r * v
f: forces des frottement;
η: viscosité du milieu;
r: rayon de la particule;
v: vitesse de migration.
Le coefficient de viscosité ή dépend de la _______________.
température
Il arrive un moment où les forces de mobilité et les forces de frottement s’équilibrent, et la particule se déplace alors à vitesse constante; on peut alors écrire: _____________________.
F=f;
Q.E = 6Π * η * r * v;
v= Q.E / 6Π.η.v
On définit pour chaque particule sa mobilité μ, de manière indépendante du champ électrique, par la relation: _____________________.
µ = Q/ 6Π.η.r
La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d’effectuer une séparation en se basant sur cette propriété. (V/F)
V
La différence ________ détermine l’intensité de la charge Q d’une particule : plus cette différence est grande en valeur absolue, plus la charge est __________.
pH - pHi;
importante.
Si pH > pHi, la charge nette est ________, et la particule migre vers la _________.
négative;
anode (+).
Si pH < pHi, la charge nette est ________, et la particule migre vers la _________.
positive;
cathode (-).
Si pH = pHi, la charge nette est ________, et la particule migre vers la _________.
nulle;
elle ne migre pas.
La mobilité électrophorétique dépend de plusieurs facteurs: ____________, ___________, ____________, ___________, ____________, _____________.
a. Charge électrique nette;
b. Intensité du champ électrique;
c. Température;
d. Taille et géométrie de la molécule (forces de frottement);
e. Viscosité du tampon;
f. Courants liquidiens [courant d’électrolyse, courant d’évaporation (rhéophorèse), courant d’électro-endosmose (ou électro-osmose)]
Il existe principalement deux types d’électrophorèse: ________________ et ________________.
- Electrophorèse libre en veine liquide;
- Electrophorèse de zone sur support.
L’_____________________ est une technique où l’échantillon est contraint de se déplacer à travers une phase solide, généralement un gel ou une matrice, sous l’influence d’un champ électrique.
Electrophorèse sur support solide
Techniques d’Electrophorèse de zone sur support: ____________, __________, ___________, ___________, ____________, ____________, ______________, ______________, _______________, _______________.
Electrophorèse sur Papier filtre (membrane);
Electrophorèse sur Acétate de cellulose (membrane);
Electrophorèse sur gel d’Amidon (milieu gélifié);
Electrophorèse sur gel d’Agar-agar (milieu gélifié);
Electrophorèse en gel d’Agarose (milieu gélifié);
Electrophorèse sur gel de Polyacrylamide (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis);
Focalisation isoélectrique (électrophorèse dans un gradient de pH);
Electrophorèse bi-dimensionnelle;
Electrophorèse en champ pulsé;
Immunoélectrophorèse.
Pour _________________, l’électrophorèse est en milieu liquide et aussi la migration.
ÉLECTROPHORÈSE LIBRE OU DE FRONTIÈRE
Il existe deux techniques d’électrophorèse libre ou de frontière: _____________ et ______________.
Electrophorèse En veine liquide;
Electrophorèse Capillaire de silice.
L’électrophorèse en veine liquide, également appelée électrophorèse libre est réalisée dans un _________________, permettant ainsi des mesures optiques à travers le tube, comme dans une _______________________.
tube en U de section carrée;
cuve de spectrophotomètre.
Electrophorèse en veine liquide
La séparation n’est pas totale, mais les frontières qui se forment sont mises en évidence par des méthodes _____comme ___________, ___________, ____________.
optiques;
absorption UV;
indice de réfraction;
fluorescence.
Electrophorèse en veine liquide
La migration s’effectue au sein d’un ___________________ soumis à un ___________________ continu.
liquide de composition déterminée;
champ électrique de courant.
L’électrophorèse de zone repose sur l’utilisation d’un __________ pour stabiliser la phase liquide.
support poreux
Electrophorèse de zone
Le support doit être ________, ________ et _________.
homogène;
poreux;
inerte.
Différents types de support peuvent être utilisés en Electrophorèse de zone: _______________ et ______________.
- Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s’effectue à la surface de celui-ci);
- Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des mélanges s’effectue à l’intérieur même du support).
Électrophorèse sur gel
Le gel est constitué d’une ______________baignant dans un _______________.
matrice de polymère (agarose et polyacrylamide);
tampon conducteur.
Électrophorèse sur gel
Les gels d’usage commun, l’agarose et le polyacrylamide, possèdent des pores de la taille des ____________.
protéines à séparer
Électrophorèse sur gel
La séparation moléculaire est basée non seulement sur la ________________ des molécules, mais aussi sur le principe de ______________.
mobilité électrophorétique;
filtration sur gel.
Électrophorèse sur gel
Les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille ___________.
plus grande
Électrophorèse sur gel
Le champ électrique et le tamis moléculaire agissent en ____________, ce qui produit un effet de vitesse de migration différentielle selon la ______, _______ et ________ des particules.
sens contraire;
taille;
forme;
charge.
Supports possibles pour l’électrophorèse sur gel: __________, _________, __________, ___________, ___________, ____________.
Papier;
Acétate de cellulose;
Gel de polyacrylamide;
Gel d’agarose;
Gel d’amidon;
Gel de silice.
Méthodes possibles pour l’électrophorèse sur gel: _________, ________, __________.
- Sur bande (papier, acétate de cellulose);
- Sur lame;
- En tube.
Electrophorèse libre - Lecture des résultats
L’_________________ permet de capter les variations de l’______________ sur l’une des branches du tube en U.
enregistrement photographique;
indice de réfraction.
Electrophorèse libre - Lecture des résultats
Dans le cas de l’électrophorèse capillaire, la ______________ est utilisée, avec un enregistrement des _____________ en fonction du temps.
lecture photométrique;
variations d’absorbance.
Électrophorèse de zone - Lecture des résultats
Après la migration des substances, il est nécessaire de révéler les fractions séparées, comme en ____________________.
chromatographie sur couche mince.
Électrophorèse de zone - Lecture des résultats
Dans certains cas, les substances peuvent être _____________ ou ___________, facilitant ainsi leur identification.
naturellement colorées;
fluorescentes.
Applications de l’Electrophorèse classique: _____________, ____________, _____________, _____________, ______________.
- Déterminer le nombre de sous-unités d’une protéine et leur masse molaire respective;
- Evaluer le degré de purification d’une protéine ;
- Séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps) ;
- Séquencer l’ADN et de déterminer la taille de fragments d’ADN ;
- Séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN).
L’électrophorèse capillaire convient aussi bien pour l’analyse _______________ que ________________.
qualitative;
quantitative.
L’électrophorèse capillaire se définit comme une technique de séparation électrophorétique effectuée dans un tube de diamètre interne < ___ µm , rempli d’un ___________.
100;
milieu électrolyte.
L’électrophorèse capillaire permet la séparation rapide de molécule _________, avec une ___________.
très variée;
grande résolution.
Appareillage de l’électrophorèse capillaire: ______________, _______________, ________________, ______________, _____________, _______________, ________________.
- Tube capillaire en silice fondue;
- Détecteur;
- Thermo stabilisation du capillaire;
- Electrodes;
- Flacons;
- Système d’introduction des échantillons;
- Système d’enregistrement automatisé.
Electrophorèse capillaire
Les caractéristiques du Tube capillaire en silice fondue: ________________, ___________________.
- 50 à 100 μm de diamètre interne recouvert de polyimide à l’extérieur (jaune) souplesse et rigidité;
- Extrémités du capillaire plongent dans un réservoir de tampon (capillaire se remplit).
Electrophorèse capillaire
Le Détection en ligne est une fenêtre de détection au niveau d’une portion capillaire dépourvu de __________.
polyimide
Electrophorèse capillaire
Le détecteur le plus courant ________________.
détecteur UV (détecteur à filtre ou à barrette de diode)
La thermostabilisation du capillaire maintient le ____________ constant pendant l’analyse.
temps de migration
Electrophorèse capillaire
Dans les flacons 2 électrodes de _________sont reliées à un __________________.
platine;
générateur de T° (0 à 30 kV).
Electrophorèse capillaire
Les flacons sont de __ à __ ml en _________, contenant le tampon ou l’échantillon.
2 à 4 ml;
CLHP.
Electrophorèse capillaire
En général, on _____________ pour introduire l’échantillon.
applique une Pression sur le flacon
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Le capillaire est rempli d’un ____________ et ses deux extrémités sont plongées dans deux compartiments remplis avec une solution d’___________ de même composition que le tampon de migration.
tampon de migration;
électrolytes.
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Le plus généralement, l’échantillon est introduit à l’extrémité _________ du capillaire et ce, en plongeant cette extrémité dans le compartiment échantillon.
anodique
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Dès que le volume d’échantillon à analyser est _______________, l’extrémité anodique est replacée dans le compartiment anodique d’électrolytes.
entrainé dans le capillaire
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Les volumes d’échantillon introduits sont de __ à __ nL.
1 à 50
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Une tension de __ à 30 __ est appliquée entre les deux compartiments, soit, aux extrémités du capillaire et le champ électrique généré et de ___ à ___ V/cm.
10 à 30 kV;
100 à 500 V/cm.
Electrophorèse capillaire - Mode opératoire
Le détecteur est généralement placé vers l’extrémité ______________.
cathodique
Sur l’______________ est représenté le signal donné par le détecteur en fonction du temps.
électrophorégramme
Chaque analyte donne un signal à un temps de migration qui correspond au temps mis par cet analyte pour parcourir le capillaire du ____________ jusqu’au _____________.
point d’injection;
détecteur.
La portion du capillaire où la séparation des analytes a lieu et est mesurée entre le point d’injection de l’échantillon et le détecteur est dite ________________.
longueur effective ou longueur utile du capillaire. (l)
Interprétation de l’ électrophorégramme:
1. -Analyse qualitative : _________________________;
2. -Analyse quantitative : _______________________.
- Mise en évidence de la présence d‘espèces ioniques et identification en fonction du Temps migration;
- Mise en évidence par le rapport Aire du pic/Temps directement proportionnel à la concentration.
La séparation des composés par EC résulte de deux mécanismes de transport:
____________ et _____________.
Electromigration;
Electroosmose.
La vitesse de migration d’un composé, sous l’effet d’un champ électrique d’intensité E, est déterminée par la _______________ de ce composé et par la __________________ du tampon contenu dans le capillaire.
mobilité électrophorétique;
mobilité électro-osmotique.
L’électromigration dépend surtout de ____________ et ___________.
- Vitesse EP;
- Mobilité électrophorétique propre μep.
La vitesse de migration électrophorétique νep d’un soluté, supposé de forme sphérique, est donnée par l’équation: ___________________________.
vep = µep * E = (q/6πηr) (V/L)
η: Viscosité de la solution d’électrolytes;
r: Rayon de Stoke du soluté;
V: tension appliquée;
L: Longueur totale du capillaire.
L’éléctromigration s’effectue: __________________ et ____________________.
- Dans le sens du champ électrique (μ ep positive) pour les cations;
- Dans le sens opposé pour les anions (μ ep négative).
Le phénomène d’_______________ correspond à l’écoulement et l’interaction d’un liquide remplissant un capillaire (dont la paroi interne possède une charge de surface) lorsque celui est soumis à un champ électrique ___________.
électro-osmose;
tangentiel.
Dans le cas d’un capillaire en silice fondue vierge, les charges de surface sont dues à l’ionisation négative des ____________ dès que le pH est supérieur à __.
groupements silanols;
3.
Lorsque le capillaire est rempli d’un tampon électrophorétique, les cations du tampon sont attirés vers les charges ________ de la surface du capillaire, formant ainsi une ______________________.
négatives;
double couche électrique.
Electro-osmose
La double couche électrique est constituée de _________________ et _______________.
- Une couche immobilisée, fortement adsorbée aux groupements silanoates, collée à la paroi. (couche statique);
- Une couche quelque peu mobile (couche diffuse) avec une prédominance en cations.
Electro-osmose
La double couche électrique est caractérisée par un ___________ ou ____________.
potentiel de surface ou potentiel zéta (ζ)
Potentiel zéta: ζ = _____________________.
ζ = η.µeo/ε
η: Viscosité;
µeo: Mobilité électroosmotique;
ε: Constante diélectrique du milieu.
Lors de l’application d’un champ électrique aux bornes du capillaire, les cations de charge opposée à celles de la surface du capillaire de silice fondue et présents en excès dans la couche de _______ migrent vers la ________ et entraînent avec eux les molécules de solvant, créant ainsi un écoulement de toutes les espèces présentes au sein du capillaire, on parle de l’ ______________.
diffusion;
cathode;
électroosmose.
La vitesse linéaire de de l’écoulement électroosmotique: veo = __________.
veo = µeo * E
La mobilité électroosmotique est égale à __________________.
µeo = ζε/η
Formule générale de la veo: ______________________.
veo = µeo . E = (ζε/η) * (V/L)
V : tension appliquée,
L : longueur totale du capillaire.
La ______________ correspond à la vitesse réelle de migration des molécules au sein du capillaire et correspond à la somme de la _______________ et de la ________________.
mobilité apparente;
mobilité électrophorétique;
mobilité électroosmotique.
µapp = µEP + µEO
Mobilité apparente - Cation
μEP > 0 (q>0) et μEOS > 0 => μAPP = μEP + μEOS => migration vers la __________.
cathode (-).
Mobilité apparente - Anion
μEOS > |μEP| et μAPP = μEOS -|μEP|=> μAPP > 0 => _____________________.
migration vers la cathode
Mobilité apparente - Anion
μEOS < |μEP| et μAPP = μEOS -|μEP|=> μAPP < 0 => ___________________.
pas de migration vers la cathode
Mobilité apparente - Molécule neutre
μEP = 0 => μAPP = μEOS => ____________________.
migration vers la cathode
Pour chaque soluté, la vitesse apparente est calculée à partir du ______________ figurant sur l’électrophorégramme.
Vapp = __________________________.
temps de migration;
ѴAPP = l / tm
l= longueur effective ou longueur utile du capillaire (de l’injection à la détection);
Tm = temps de migration de l’analyte.
La vitesse électroosmotique est calculée à partir du temps de migration d’un marqueur neutre dont la vitesse électrophorétique est ____. Le marqueur ne doit pas être _______________________.
nulle;
entrainé que par le flux électroosmotique.
Le marqueur neutre est introduit avec l’échantillon et le composé le plus utilisé est le __________.
méthanol
En pratique, ѴEOS = _____________________.
ѴEOS = l / tmARQ N
l= longueur effective ou longueur utile du capillaire (de l’injection à la détection);
Tm = temps de migration du marqueur neutre.
En pratique, la vitesse électrophorétique est déduite ainsi: ________________.
ѴEP = ѴAPP - ѴEOS
Les grandeurs caractéristiques de l’électrophorèse capillaire: ____________, ___________, _____________.
- Temps de migration;
- Efficacité;
- Résolution.
Le nombre de plateaux théoriques en EC est exprimé par l’équation suivante:
N = ____________________.
N = (µep +µeo) * V * l / 2 * D * L
N : nombre de plateaux théoriques;
l : longueur de l’injection à la détection;
L : longueur totale du capillaire;
μeo : mobilité électro-osmotique;
μep : mobilité électrophorétique;
DM : coefficient de diffusion du composé;
V : tension.
En électrophorèse capillaire, la résolution RS entre deux espèces est égale à:
Rs = _______________________.
Rs = √N (µepb - µepa) / 4 (µep + µeo)
N: Nombre de plateaux théoriques;
µepb et µepa: mobilité électrophorétique des deux espèces;
µep: mobilité électrophorétique moyenne des deux espèces:
µeo: Mobilité électroosmotique.
Sur la majorité des appareils commerciaux, 02 modes d’introduction de
’échantillon dans le capillaire sont proposés: __________________ et ___________________.
- Injection hydrodynamique (par pression);
- Injection électrocinétique.
L’injection électrocinétique est fondée sur l’introduction des solutés dans le capillaire par application d’une ________ pendant un temps ___________.
tension;
très court.
Principe de l’injection électrocinétique
Les solutés migrent dans le capillaire sous l’effet d’un champ électrique, avec des vitesses de déplacement qui sont fonction de leurs ____.
mobilité électrophorétique
Deux procédés de détection existent pour EC: ___________ et ____________.
- Détection “ON – COLUMN”;
- Détection “OFF - COLUMN”.
Deux modes de détection existent pour EC: ___________ et ____________.
- Détection “DIRECTE”;
- Détection “ INDIRECTE”.
Les modes de détection commercialisés en EC sont: _______________, _____________, ______________, ________________.
- Les spectrométries UV/visible à longueur d’onde fixe ou variable, à barrette de diodes, Limite de détection LD= 10−5 et 10−moles;
- La fluorescence laser, LD = 10−15 et 10−17 moles;
- La spectrométrie de masse. LD = 10 -16 –10 -17 moles;
- Méthodes de détection indirecte.
Il est possible de différencier les modes de séparation par électrophorèse capillaire selon : _______________ et ________________.
- Le système d’électrolyte (continu ou discontinu);
- La concentration en électrolyte (isocratique ou en gradient).
Système d’électrolyte continu : Le tampon de séparation est composé de_______________________.
un seul électrolyte
Système d’électrolyte discontinu : Le tampon de séparation est composé de ___________________________.
deux électrolytes de natures différentes.
Mode isocratique : La concentration du tampon en électrolytes est _____________.
constante
Mode gradient : La concentration du tampon en électrolytes _____(Analogie avec le __________________)
varie;
gradient d’élution en HPLC.
Les techniques EP à système continu isocratique: ___________, _________, __________, _____________.
ECZ : Electrophorèse capillaire libre ou de zone;
CEM : Chromatographie électrocinétique micellaire;
ECC : Electrochromatographie capillaire;
ECG : Electrophorèse capillaire sur gel.
Les techniques EP à système continu en mode gradient: ________________.
IEFC : Isoélectrofocalisation capillaire.
Les techniques EP à système discontinu: ________________.
ITPC : Isotachophorèse capillaire
Applications pharmaceutiques de l’EC: ______________, _____________, ______________, ________________.
- Mise en évidence des impuretés et produits de dégradation dans les matières premières (solvants résiduels) ;
- Résidus de détergents dans les cuves de fabrication;
- Dosage de principes actifs ;
- Contrôle de la pureté énantiomérique.
En biologie, on fait recours à l’EC pour _________________ dont: ______________, ______________, _____________, ________________, __________________.
Analyse des macromolécules organiques complexes;
- EC des protéines sériques et caractérisation des composants monoclonaux.
- EC des protéines urinaires pour caractériser les types de protéinurie.
- EC des lipoprotéines (LDL,HDL) et de leurs sous fractions par iso tachophorèse.
- EC sur gel capillaire pour l’analyse des acides nucléiques.
- Électrophorèse des glycoprotéines et glycolipides.
