Secuenciación masiva de genomas

Question 1

qué es la secuenciación?

Answer 1

metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden de las bases nitrogenadas en la cadena de ADN

Question 2

quién hizo la primera metodología de secuenciación en 1977?

Answer 2

Frederick Sanger

Question 3

en qué se basó la metodología de Sanger?

Answer 3

radiografía de electroforesis
adición de ddNTPs

Question 4

qué identificaba la metodología de Sanger?

Answer 4

orden de bases N gracias a que le ponía radioactividad

Question 5

cómo se replica la molécula de ADN en el método Sanger?

Answer 5

con ayuda de la ADN polimerasa

Question 6

que hacen los ddNTPs en el método Sanger?

Answer 6

terminadores, porque no cuentan con el OH en 3’ de la ribosa
terminación aleatoria de cadena

Question 7

como tiene que ser la cadena de DNA para Sanger?

Answer 7

sencilla

Question 8

con qué se amplifica un fragmento de DNA en Sanger?

Answer 8

DNA polimerasa

Question 9

cuántos fragmentos de nucleótidos se pueden leer una vez amplificado el fragmento de DNA?

Answer 9

50-300 NTDs

Question 10

qué pasa cuando ya tienes nucleótidos específicos?

Answer 10

puedes separar cadenas de diferentes tamaños

Question 11

secuenciación de Sanger

Answer 11

1. cadena
2. 4 tubos, en c/u 4 NTD con H
3. en cada tuvo un ddNTP marcado
4. ddNTPs se pegan NTPs, hebras se van cortando
5. se separan por tamaños, grandes arriba, pequeñas abajo
6. por tamaño interpretas y creas la secuencia

Question 12

qué se necesita para Sanger?

Answer 12

ddNTPs
dNTPs
polimerasa
primers
MgCl2

Question 13

qué se usa en vez de la radioactividad en la actualidad?

Answer 13

fluorescencia

Question 14

cómo funciona la fluorescencia?

Answer 14

por medio de un láser el color, se manda al software para verlo en computadora

Question 15

cuántas muestras permite amplificar el método de fluorescencia?

Answer 15

96 en una sola corrida

Question 16

cuántos fragmentos se pueden ampliar por muestra con la técnica de fluorescencia?

Answer 16

30-60k

Question 17

cuáles son los 3 pasos de la secuenciación automatizada?

Answer 17

1. PCR con fluorescencia (cadena terminada con ddNTPs)
2. separación de tamaños con gel de electroforesis
3. excitación con láser y detección por maquina de secuenciación

Question 18

a qué se refieren con next generation sequencing (NGS)?

Answer 18

técnicas de secuenciación posteriores a la de Sanger.

Secuenciación masiva y paralela de fragmentos de DNA

Question 19

qué es cobertura?

Answer 19

la cantidad de veces que se ha leído un nucleótido específico durante un proyecto de secuenciación del ADN

Question 20

qué es la profundidad?

Answer 20

cuántas veces se evalúa un fragmento y que esté correcto en cada fragmento.
“ver si es A toda la fila que debe ser A”

Question 21

tipos de secuenciación

Answer 21

por hibridación

secuenciación de una molécula en tiempo real

Question 22

tipos de secuenciación por hibridación

Answer 22

454 Pirosecuenciación SOLID (Roche)
Solexa (Illumina)

Question 23

la pirosecuenciación usa gel de acrilamida?

Answer 23

no

Question 24

cuántos fragmentos secuencia la pirosecuenciación?

Answer 24

200-400pb

Question 25

en la pirosecuenciación, al adicionar el NTP a la cadena de ADN, qué se libera?

Answer 25

Pi

Question 26

por qué se degradan los dNTPs que no se unan a la cadena de ADN en la pirosecuenciación?

Answer 26

apirasa

Question 27

cómo se detecta la luz en la pirosecuenciación?

Answer 27

reacciones enzimáticas secuenciales
Ppi—ATP—luz visible

Question 28

para qué es la pirosecuenciación más moderna?

Answer 28

para secuencias más cortas

Question 29

qué es Illumina (SOLEXA)?

Answer 29

amplificación “en puente” o cluster PCR

Question 30

qué pasa en Illumina?

Answer 30

1. se pliegan por tener fragmentos que son afines
2. polimerasa duplica puente

Question 31

qué es la librería de ADN?

Answer 31

clonación de fragmentos de DNA insertados en un vector

Question 32

cómo se ven los nucleótidos en la PCR por emulsión Ion Torrent?

Answer 32

por pH, porque al unirse los nucleótidos se libera un H+