Secuenciación masiva de genomas Flashcards
qué es la secuenciación?
metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden de las bases nitrogenadas en la cadena de ADN
quién hizo la primera metodología de secuenciación en 1977?
Frederick Sanger
en qué se basó la metodología de Sanger?
radiografía de electroforesis
adición de ddNTPs
qué identificaba la metodología de Sanger?
orden de bases N gracias a que le ponía radioactividad
cómo se replica la molécula de ADN en el método Sanger?
con ayuda de la ADN polimerasa
que hacen los ddNTPs en el método Sanger?
terminadores, porque no cuentan con el OH en 3’ de la ribosa
terminación aleatoria de cadena
como tiene que ser la cadena de DNA para Sanger?
sencilla
con qué se amplifica un fragmento de DNA en Sanger?
DNA polimerasa
cuántos fragmentos de nucleótidos se pueden leer una vez amplificado el fragmento de DNA?
50-300 NTDs
qué pasa cuando ya tienes nucleótidos específicos?
puedes separar cadenas de diferentes tamaños
qué se necesita para Sanger?
ddNTPs
dNTPs
polimerasa
primers
MgCl2
qué se usa en vez de la radioactividad en la actualidad?
fluorescencia
cómo funciona la fluorescencia?
por medio de un láser el color, se manda al software para verlo en computadora
cuántas muestras permite amplificar el método de fluorescencia?
96 en una sola corrida
cuántos fragmentos se pueden ampliar por muestra con la técnica de fluorescencia?
30-60k
cuáles son los 3 pasos de la secuenciación automatizada?
- PCR con fluorescencia (cadena terminada con ddNTPs)
- separación de tamaños con gel de electroforesis
- excitación con láser y detección por maquina de secuenciación
a qué se refieren con next generation sequencing (NGS)?
técnicas de secuenciación posteriores a la de Sanger.
Secuenciación masiva y paralela de fragmentos de DNA
qué es cobertura?
la cantidad de veces que se ha leído un nucleótido específico durante un proyecto de secuenciación del ADN
qué es la profundidad?
cuántas veces se evalúa un fragmento y que esté correcto en cada fragmento.
“ver si es A toda la fila que debe ser A”
tipos de secuenciación
por hibridación
secuenciación de una molécula en tiempo real
tipos de secuenciación por hibridación
454 Pirosecuenciación SOLID (Roche)
Solexa (Illumina)
la pirosecuenciación usa gel de acrilamida?
no
cuántos fragmentos secuencia la pirosecuenciación?
200-400pb
en la pirosecuenciación, al adicionar el NTP a la cadena de ADN, qué se libera?
Pi
por qué se degradan los dNTPs que no se unan a la cadena de ADN en la pirosecuenciación?
apirasa
cómo se detecta la luz en la pirosecuenciación?
reacciones enzimáticas secuenciales
Ppi—ATP—luz visible
para qué es la pirosecuenciación más moderna?
para secuencias más cortas
qué es Illumina (SOLEXA)?
amplificación “en puente” o cluster PCR
qué pasa en Illumina?
- se pliegan por tener fragmentos que son afines
- polimerasa duplica puente
qué es la librería de ADN?
clonación de fragmentos de DNA insertados en un vector
cómo se ven los nucleótidos en la PCR por emulsión Ion Torrent?
por pH, porque al unirse los nucleótidos se libera un H+
