Fundamentos de PCR Flashcards
qué es una PCR?
reacción en cadena de polimerasa
quién introdujo la PCR y en qué año?
Mary Mullis en 1983
técnica de replicación in vitro de una molécula de ADNg
PCR
por qué se delimita la longitud del fragmento que se quiere replicar en una PCR?
primers o cebadores u oligonucleótidos
qué es el ADNg?
ADN genómico normal
PCR convencional
- amplificación de una región genética específica
- evaluación —> gel de agarosa o acrilamida
PCR cualitativo
- identifica presencia o ausencia de un fragmentos específico
- dx de enfermedades infecciosas
PCR semicuantitativo
- permite conocer niveles de expresión de un gen (ARNm) (biopsias)
PCR cuantitativo
- mide cantidad de microorganismos en ARNm
- como referencia —> curva con muestras con concentraciones conocidas
PCR múltiple
- amplificación de varias regiones génicas en una sola PCR
cuáles son los principios básicos de una PCR?
- complementaridad
- dirección 5’ —> 3’ (3’ debe de estar libre)
cuáles son las 3 etapas de una PCR?
desnaturalización
replicación
elongación
qué componentes se requieren para la PCR?
ADN
PRIMERS
DNA polimerasa
dNTPs
Magnesio (cofactor)
la DNA polimerasa ocupa de manera indispensable el __
magnesio
qué son los dNTP’s?
desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada
cuál es la función de los dNTP’s?
estabilidad
formar enlace fosfodiester (nucleótido - nucleótido)
con 50-200mM (dNTP’s) se sintetiza —>
6.5-25 mg de ADN
a cuántos grados y por cuánto tiempo se desnaturaliza el ADN? inicio
95°C
5 min
cuáles son los 3 ciclos de amplificación en la PCR?
desnaturalización (95°, 30s)
alineamiento (50-60°, 30-40s)
extensión (72°)
a cuántos grados es la amplificación final?
72°
a cuántos grados es el almacenamiento temporal de la PCR?
4°C
cuándo se ponen los primers?
en el alineamiento
cuántos ciclos de amplificación son?
35 aprox
cuántas copias de DNA se pueden obtener una sola hebra?
muchas
cómo es el proceso de visualización de amplificación PCR punto final?
- agarosa/acrilamida
- gel a la cámara y buffer de corrimiento
- pipetear muestras y marcador
- corrimiento
- comparar bandas de muestras vs marcador PM
quién describió una la PCR en tiempo final y en qué año?
Higuchi 1992
cómo se le llamó a la adaptación que hizo Higuchi?
PCR tiempo real/cuantitativa
en la PCR de tiempo real se va observando el crecimiento de __
la curva de amplificación
cuál es la ventaja de la PCR en tiempo real?
la puedes usar como cuantitativa o cualitativa
cuáles son los pasos de la PCR en tiempo real?
Amplificación:
- desnaturalización
- alineamiento
- extensión
Detección —> fluorescencia
- SYMBER green
TaqMan
SYBER GREEN es un intercalante y se inserta al __
medio de la cadena
SYBER GREEN más usado
bromuro de etidio
para qué se usa TAQMAN?
identificar SNPs
la sonda de TAQMAN es __ para una región que quieras identificar
específica
función principal de SYBR GREEN
expresión
cuáles son los 2 fluoróforos que tienen las sondas?
VIC
FAM
cuáles son las ventajas de PCR en tiempo real?
- calcula eficiencia de reacción
- no es necesario correr geles de agarosa
- mayor rapidez y eficiencia
cuáles son las aplicaciones de la PCR en tiempo real?
análisis de expresión (cáncer)
investigación (polimorfismos asociados a enferemdades) estudios caso-control
dx de enfermedades (SARS-COV2)
