Rekombinant DNA-kloning

Question 1

Plasmid-vektorer har multiple cloning site. Vad innehåller dessa?

Answer 1

multiple cloning site innehåller klyvningsställen för restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer känner igen specifika sekvenser.

Question 2

Hur går rekombinant DNA-kloning till?

Answer 2

Rekombinant DNA-kloning går till genom att skapa identiska kopior av DNA. Det intressanta DNA-fragmentet kombineras med en vektor för att få en rekombinant DNA (rDNA)-molekyl. rDNA:t introduceras till en värdcell DNA:t böjar att reproduceras genom multiplikation av celler.
Om man bara för in DNA:t kommer det inte att fungera, det krävs alltså en plasmid.

Question 3

Man kan använda rekombinant DNA-kloning inom farmakologiska områden för att producera:
…..ge 4 exempel

Answer 3

insulin
human growth hormone
blood clotting factor
hepatitis B vaccine.

Question 4

Rekombinant DNA-kloning används för för produktion inom farmakologiska områden. Ge ex på andra användningsområden.

Answer 4

Man kan också använda rekombinant DNA-teknologi för att identifiera ärvda sjukdomar genetiskt och diagnostisera HIV.

Question 5

Om man ser att någon som framgångsrikt behandlats med antivirala läkemedel mot HIV plötsligt har en låg mängd T-celler byter man troligen läkemedel.
Hur testar men patienten för resistens?
Samt vilka de viktigaste verktygen för att lösa problemen är.

Answer 5

Test för resistens

1. Blodprov från HIV-patienten
2. Isolerar HIV-genen
3. Klonar HIV-genen
4. Sekvenserar genen (och kollar för olika mutationer)
5. Hittar en passande behandling eller ett passande läkemedel

De viktigaste verktygen för att lösa problem är:

• Den intressanta genen (DNA-genom cDNA, PCR-amplifierat DNA)
• Vektorer (plasmider)
• Endonukleaser (restriktionsenzymer)
• Bakterier (E. coli)

Question 6

Vad är en vektor?

Answer 6

Vektorer är en DNA-molekyl som fungerar som ett fordon för att föra främmande genetiskt material in i andra celler, där det kan replikeras eller uttryckas.
Vektorer som bär på främmande DNA kallas för rekombinant DNA.
Olika vektorer kan vara:
- Plasmider
- Bakteriofager
- Cosmider
- Artificella kromosomer

Question 7

Vart finns plasmider?

Answer 7

Plasmider finns i bakterier som extra-kromosomala cirkulära dubbelsträngade DNA-molekyler som självständigt kan replikeras.

Question 8

Vilka viktiga faktorer har den plasmid vi använder i labben?

Answer 8

1: Ori, origin of replikation
2: MCS (multiple cloning sites)
- Innehåller flera klyvningsställen
- Inne i MCS för vi in vårt intressanta DNA
3: Genetiska markörer (t.ex. gener som kodar för antibiotika-resistens.
- Selektionsmarkörer
- Vi vill att bara bakterier som innehåller vår gen ska växa på plattan
- Andra bakterier som inte bär på plasmiden ska dö

Question 9

Vad är E.Coli och hur kan denna transformeras?

Answer 9

E. coli är en gramnegativ, stavformad bakterier som finns i mag-tarm kanalen och som kan orsaka diarré.
Man transformerar genom att använda rekombinanta plasmider och värdcellen E. coli. Cellen måste vara kompetent. Därefter utsätts bakterierna för en värmechock, så att cellväggen öppnar upp sig och tar in plasmider.
Selektionsmarkörer som vi använder är ampr-genen som kodar för beta-laktamas.
Bara celler med vektor-DNA:t kommer att växa. LacZ-genen finns naturligt i E. coli och kodar för β-galaktosidas. Den bryter ner laktos till glukos och galaktos. X-gal är en analog för laktos som i närvaron av IPTG (aktiverar transkription av LacZ-produkten). Då får man blåfärgade kolonier. Det är celler som bara innehåller plasmider.
När man klyver MCS med restriktionsenzymer kommer LacZ att inaktiveras. Inga blåa kolonier ska alltså växa. I en optimal värld ska man bara få vita och blåa kolonier. Vita kolonier innehåller de intressanta generna. Det kallas för “white screen”.
LB agarplattorna innehåller ampicillin (antibiotika) som är en selektionsmarkör. Bara bakterier resistenta för ampicillin ska leva på plattan. Den ska också innehålla IPTG och X-gal.
Man ska blanda ett rör med bakterien och utsätta dem för en värmechock.