Att utforska proteiner Flashcards
Nämn de 4 fysikaliska/kemiska egenskaperna hos proteiner. (bestäms av aminosyrasekvensen)
- Storlek: Antal aminosyror
- Struktur: Interaktion mellan aminosyror
- Laddning: Antal laddning på aminosyror
- Löslighet: hydrofoba/hydrofila aminosyror
mha sekvensen på ett protein kan vi hitta metod för att rensa ut proteinet.
Proteinrening (isolering)
Startmaterial - celler som uttrycker proteinet i fråga, finns två grupper; Endogent och Rekombinant. Vad innebär dessa?
Endogent: Vävnad eller cellkultur men naturligt uttryck av proteinet.
Rekombinant: Överuttryck i cellkultur (bakterier eller eukaryota celler) som bär konstgjord kopia av genen som kodar för proteinet (tillåter modifikation av gen ) (kan tillverka större mängd).
Nämn 4 steg för (fram till) proteinrening.
1) Utgångsmaterial (rekombinant/endogent)
2) Sönderdela cellen (lysera)
3) Centrifugering (tar bort oönskat material)
4) Rening (ofta i flera steg) Baserat på storlek, laddning, löslighet, affinitet.
Vilka metoder kan användas för att följa reningen av protein?
Aktivitetsanalys/SDS-PAGE och Western Blot
Vad innebär Ultracentrifugering?
- Man utnyttjar centrifugala krafter (g-tal) och tvingar partiklar att färdas genom en vätska.
- En partikels vandringshastighet är direkt proportionell med dess sedimentationskoefficient massa, densitet och form.
- Finns 2 metoder: Sedimentationscentrifugering och densitetsgradientcentrifugering.
Membrandialys
Avseende STORLEK
- Man får sitt prov med oönskade små partiklar
- Man använder semipermiabelt membran som släpper ut de små partiklarna.
- Sänker ner provet i en lösning–> jämvikt
- Byter ut lösningen - upprepas
- Kan användas för att få bort mindre proteiner
- Olika membran - olika porstorlek, lågintensivt
- Används vid buffertbyte
Gelfiltrering
Avseende STORLEK
Kolonn med dextrankulor (polymer, socker) i mitten.
Små molekyler från provet går in i kulorna - längre tid.
Större molekyler passerar kulorna utan att gå in i dem och åker först ur kolonnen. Störst protein kommer alltså först ur kolonnen.
Jonbytarkromatografi
Avseende LADDNING
Sortera proteiner med olika laddning.
Kolonn med laddade kulor binder till proteiner med motsatt laddning. Resterande proteiner åker rakt igenom.
Elueras sedan ut genom att reglera salthalten –> Vi får då ut det önskade proteinet med den massa/volym som vi redan känner till.
Höga salthalter –> risk för denaturering.
Affinitetsrening
(väldigt effektiv och specifik)
- Kolonnmatris med kovalent bunden molekyl
- Hög affinitet till proteinet
- Ex ligander, antikroppar, substrat, metalljoner, DNA eller glukos.
3 steg:
1) Specifik inbindning av proteinet
2) Tvättning (få bort obundna proteiner)
3) Eluering av bundet protein genom specifik ersättning.
Ge exempel på vad som kan användas för eluering av bundet protein i en affinitetsrening.
- Glukosbindande protein: Glukos bundet till kolonnen, glukos eluerar (kräver ingen modifikation av proteinet).
- Histidin taggat protein Nickel agaros, imidazol eluerar (histidinanalog).
- Flag-taggat protein. Flag-tag antikropp , Flag-peptid eluerar.
- De två sista kräver rekombinant (modifierad) protein med specifika reningstaggar.
Vad menas med analysmetoder?
Reningsmetoder används för att rena ut stora mängder protein, sedan analyserar man proteinet. Ex:
- Följa en reningsprocess (SDS-PAGE)
- Påvisa närvaro av ett visst protein (Proteomik, Western Blot, ELISA).
- Undersöka egenskaper hos ett protein (mass-spectrometri, röntgenkristallografi- 3D-struktur, NMR 3D-struktur).
Elektrofores
En molekyl med nettoladdning kommer förflytta sig i ett elektriskt fält.
- Oftast utförd i någon typ av gel –> fungerar som sil, (man styr hastigheten genom att reglera gelens täthet).
- Migrationen beror på molekylens STORLEK och LADDNING.
- -> små molekyler rör sig lätt, stora svårt-bromsas av friktion.
SDS-PAGE
(den enklaste elektroforesen)
- SDS binder till proteiner med regelbundna mellanrum och gör de negativt laddade.
- Laddningen blir proportionell med massan (storlek).
- Separation- enbart med avseense på STORLEK (laddning är obetydlig). –> stort och litet vandrar lika snabbt i ett elektriskt fält, men stora molekyler bromsas i gel.
- metoden används för att föla upp reningsstegen.
- Provet blir mer och mer homogent för varje reningssteg som utförs.
- Oerhört denaturerade.
Isoelektrisk fokusering
en typ av elektrofores som tar längre tid
- Gel med pH-gradient/proteinets laddning.
- Proteiner vandrar tills de nått sitt pI (nettoladdning =0=isoelektrisk punkt)
- Ju närmre proteinet kommer sin Ip desto starkare migrerar det.
- Den isoelektriska punkten bestäms genom isoelektrisk fokusering.
2D gelelektrofores
Isoelektrisk fokusering + SDS-PAGE
- Väldigt effektiv metod för att separera proteiner, däremot kan man inte göra särskilt mycket med den. Det är små molekylära mängder och de är denaturerade.
