Nukleotider, replikation och transkription Flashcards
Kromosomer=
Nukleotider + proteiner
Vilka är de 2 purinerna? rita dessa
Adenin (A) och guanin (G)
Vilka är de 3 pyrimidinerna? rita dessa
Cytosin (C), Uracil (U), Tymin (T)
Ryggraden i DNA och RNA innehåller socker som länkas samman med ——–?
Länkas samman med fosfodiesterbindningar mellan 3´ hydroxylgrupp på ett socker med hydroxylgruppen på nästa socker.
Basen är fäst till kolatomen i position 1´.
5´–> 3´
Vad är en nukleosid?
Nukleosid = kvävebas + socker (nukleosidanalog)
Vid cancer + virus.
Kvävebasen är bunden vid 1´via en beta-glykosidbindning.
Vad är en nukleotid?
Nukleotid = Nukleosid + 1 eller flera fosfatgrupper.
1 fosfatgrupp i polynukleotidkedjor
3 fosfatgrupper i fria nukleotidkedjor som används som byggstenar. ATP (adenosin tri fosfat).
- Fosfatgrupperna sitter ihop med fosfoanhydridbindningar som är mycket energirika. Används som energivaluta.
- fosfatgrupperna räknas alfa, beta, gamma från sockret.
Nämn 4 huvudsakliga krafter som påverkar DNA-helixens stabilitet.
1) Vätebindningar: mellan C och G (3 st), samt A och T (2 st).
2) Van der Waals interaktioner: mellan närliggande baspar. kallas sticking forces.
3) Hydrofoba interaktioner: Baserna är hydrofoba –> vattnet vill ej samverka med dem. Dubbelhelixen gör att de hydrofoba baserna inte behöver interagera med det omgivande vattnet.
4) Elektrostatisk repulsion: (destabilitet)
Ryggraden på DNA innehåller negativt laddade fosfatgrupper. Dessa repellerar varandra. Neutraliseras delvis av olika typer av positiva joner som finns i cellen, tex Na+.
Vad kallas den vanligaste formen (konformationen) som DNA antar?
B-DNA eller whatson-chrick helix.
Högervriden 10-10,5 bp per varv. 3,4 Å avstånd mellan baser. 1Å = 0,1 nm.
Minor groove
kedjorna i DNA-ryggraden kommer närmare varandra
Major groove
Kedjorna i DNA-ryggraden kommer längre ifrån varandra. Det är ffa hit som proteiner binder in till DNA (lättare att komma åt).
Vad orsakar minor- och major groove?
Baserna sitter vinklade
Vid replikation eller transkription måste de två strängarna/dubbla DNA helixen separeras.
Hur kan man göra detta i lab?
I lab kan man dela på strängarna genom att värma upp DNA, en process som kallas smältning eller denaturering.
Smältpunkten beror på bp (CG är starkare än AT. )
Beskriv kortfattat vad DNA-replikation innebär.
DNA-replikation;
Noggrant kontrollerad process som katalyseras av enzymet DNA polymeras, mallsträng (template strand). En primer med en fri 3´ OH-grupp och de 4 deoxyribonukleotiderna (dATP, dTTp, dCTP och dGTP). samt Mg2+ - magnesiumjon, fosfodiesterbindning - det spjälkas bort 2 fosfatgrupper –> det frigörs energi –> möjliggör processen och ger den en riktning.
Den fria nukleotiden kommer och basparar med den komplementära kvävebasen på mallsträngen.
Alfafosfatgruppen hamnar nära 3´- OH som attackerar den –> difosfaten (pyrofosfat) är instabilt och kommer att spjälkas i vatten och det frigörs kemiskt bunden energi. PPi (inorganiskt –> inget kol)
Allt cellulärt RNA syntetiseras av RNA-polymeraser.
Vad behövs för syntes av RNA?
- en enkelsträngad mall (templat strand)
- De 4 nukleotiderna (ATP, UTP, CTP, GTP) samt Mg2+ eller Ma2+
.
INGEN primer med fri 3´OH ända krävs när det gäller RNA:
RNA har en stark önskan om att baspara (hydrofob effekt + vätebindningar) det leder till olika typer av sekundärstrukturer med korta dubbelhelixar. Ge ex på en sådan.
stam loop struktur.
Vad heter det område i eukaryoter där DNA-replikationen startar?
Orgin of replication.
Vad menas med att DNA-replikationen är bidirektionell?
Den gåt åt två håll –> två replikationsgafflar.
Vad krävs för att DNA-polymeraser ska kunna börja arbeta?
DNA-polymeraser kan inte starta DNA-replikation utan en primer –> en speciell typ av RNA-polymeras (primas) syntetiserar en kort RNA-sträng (ca 5 nukleotider) som är komplementär till mallsträngen (template). RNA strängen = primern.
DNA-replikation sker i riktningen 5´-3´, men strängarna är antiparallella. Hur löser man detta problem i DNA-replikationen?
Ena DNA-strängen tillverkas genom kontinuerlig DNA-syntes (leading strand), den andra syntetiseras i form av korta fragment - okazakifragment. –> replikationsgaffeln rör sig i en riktning.
Hur långa är okazakifragmenten i eukaryoter respektive prokaryoter?
Eukaryoter: 100-200 nukleotider långa.
Prokaryoter: 1000-2000 nukleotider långa.
Vad är nukleaser för något?
Nukleaser är enzymer som bryter ner polynukleotidkedjor (DNA och RNA) genom att bryta fosfodiesterbindningar.
Vilka är de två typerna av nukleaser? Beskriv dem
Exonukleaser= Klyver av en nukleotid åt gången från ändarna (antingen från 3´eller 5´ändan). Har 5´till 3´eller 3´till 5´exonukleasaktivitet.
Endonukleaser= Klyver fosfodiesterbindningar i mitten av en längre polynukleotidkedja tex restriktionsenzymer som klyver vid en viss sekvens.
På laggingstrand finns en RNA-primer i början av varje okazaki-fragment –> RNA-primern måste bort och ersättas med DNA. Ryggraden på DNA måste sedan förslutas så det inte finns några “nicks”.
-Förklara hur RNA-primern tas bort i eukaryoter respektive prokaryoter.
Eukaryoter:
DNA-polymeras kör in i RNA/DNA-hybriden –> RNA-primern lämnar DNA och bildar en “flap-struktur” (strand displacement synthesis).
- RNA-flappen klyvs av flap endonukleas 1 (FEN1).
- Nicken i DNA-ryggraden repareras av DNA-ligas.
Prokaryoter:
DNA-polymeraset tuggar upp RNA-primern med sin 5´- 3´exonukleas aktivitet.
- När okazakifragmentet har förlängts så allt RNA är borta och endast DNA finns kvar, lämnar DNA-polymeraset platsen.
DNA-ligas binder till platsen för brottet i DNA-strängen.
Ligaset katalyserar bildandet av en fosfodiesterbindning, som sluter brottet, DNA strängen är nu kontinuerlig. Reaktionen kräver ATP.
DNA är dubbelsträngat, för att replikation ska kunna ske krävs enkelsträngat DNA, hur löser man detta?
Enzymet helikas separerar strängarna. (3´-5´). Motorproteiner som rör sig längs nukleinsyrornas fosfodiesterryggrad.
- Finns även RNA- helikas.
Vad är helikas och hur är det uppbyggt?
Helikas är ett enzym som separerar det dubbelsträngade DNAt.
Helikas är uppbyggt av 6 likadana subenheter. Det sitter runt en sträng och rör sig mha ATP hydrolys 3´-5´ändan.
Hur kan supercoils tas bort?
Topoisomeraser är enzymer som kan ändra linking number (Lk) hos DNA.
Finns två typer:
Typ 1: Tar bort supercoils, termodynamiskt gynnsam reaktion, sker utan energitillförsel, spänning.
Typ 2: Tar bort men kan också skapa supercoils. Kräver ATP.
Beskriv typ 1 topoisomeraser.
- Tar bort både negativa och positiva supercoils.
- Klyver ena DNA strängen som roterar ett varv runt den andra strängen. DNA-strängen försluts (jobbar i utsträckt sträng).
- Lk förändras på detta sätt med 2.
- Reaktionen kan upprepas.
Beskriv typ 2 topoisomeraser.
- Klyver dubbelsträngat DNA och för en annan dubbelsträngad sträcka igenom.
- Förändrar Lk med faktor 2 (jobbar i super coils).
I bakterier kallas topoisomeras typ 2 ofta för ———.
——hämmare är en viktig grupp antibiotika.
Ge ett ex på sådan antibiotika.
I bakterier kallas topoisomeras typ 2 ofta för Gyras. Gyrashämmare är en viktig grupp antibiotika.
ex på antibiotika är ciprofloxacin.
Topoisomerashämmare används även vid cancerbehandling.
Den lömska flugsvampen i mellersta och södra sverige kan ge svåra förgiftningssymtom och dödsfall. Vad är orsaken till detta?
flugsvamp innehåller Alfa-amanitin som blockerar RNA-polymeras II. Detta genom att binda till den under den latenta fasen (6-12 tim). Förstör lever och njurar. Symtom först när det är för sent, våldsamma kräkningar, buksmärta, blodiga diarreér.
Beskriv transkriptionsinitieringen i eukaryoter.
RNA-polymeras söker en plats (promotorn), dit RNA-polymeras binder för att starta transkriptionen.
Polymeraset öppnar DNA och det bildas en transkriptionsbubbla (15-17 bp) inne i RNA-polymeraset (alltså DNA öppnas inne i RNA-polymeraset).
Det bildas en RNA-DNA hybridhelix.
5´-3´ändan kodande sträng = RNA är själv och mallsträngen läses av. Liten smältning under kort period. I RNA 5´ändanfinns 3 fosfatgrupper RNA strängen sticker ut.
- Man behöver Mg2+ som hjälper till med att koordinera nukleotiderna när de kommer in (aktiva sätet). Nukleotiderna sugs in i ett hål i RNA-polymeraset.
I cellkärnan finns 3 olika RNA-polymeraser som läser av gener.
Typ 1, 2 och 3. Vad består dessa av?
RNA-polymeras:
Typ 1: 18S, 5,8S, 28S och rRNA
Typ 2: mRNA och snRNA (består av 20000 gener)
Typ 3: tRNA och 5SRNA
Finns även ett mitokondriellt RNA-polymeras.
2/3 av ribosomens massa utgörs av rRNA.
Det är en stor utmaning att hitta rätt gen i rätt cell och rätt tid.
Promotor-sekvensen och det omkringliggande DNAt kan se olika ut, men vilka 3 element brukar återfinnas här?
1) I humana celler ligger TATA-boxen kring position -25 till -30 (sekvens som är lätt att smälta).
2) Kring platsen där transkription startar (TSS) ett initialt element Inr.
- otydlig sekvenskonservering (olika i olika gener) svår att känna igen av RNA i ett stort genom.
3) Enhancers: stimulerar promotorns aktivitet. De kan ligga på långa avstånd från promotorn (mer än 10 000 bp) kan finnas flera.
Vad kort sagt är de basala transkriptionsfaktorernas gemensamma funktion?
Hur är de uppbyggda?
Hjälper RNA-polymeras att känna igen promotorn och initiera transkription.
Uppbyggda av 10 subenheter, proteinkinas och DNA-helikas.
Beskriv detaljerat första stegen i initieringen av transkription. (hur preinitieringskomplexet bildas/ser ut).
Första steget vid initiering av transkription tas när det TATA-bindande proteinet (TBP) binder till proteinets TATA-box.
TBP binder till minor groove och inducerar en kraftig böj i DNA (90 grader).
TBP ingår i ett större komplex TFIID.
- TFIID interagerar också med Inr.
- TFIIA binder in till TFIID.
- TFIIB binder in.
- RNA polymeras II binder in tillsammans med TFIIF. Tillslut kommer TFIIH och TFIIE.
Detta är preinitieringskomplexet.
Vilka 2 enzymatiska aktiviteter har TFIIH?
(startar transkription, kinas-helikas)
1) en DNA-helikas aktivitet. Smälter promotor-DNA och skapar ett enkelsträngat templat. Första transkriptionsbubblan.
2) En kinas aktivitet. Fosforylerar CTD på RNA-polymeras II (C-terminala domänen på RNA-polymeraset)
RNA-polymeras II´s CTD (C-terminala domän); vad har den för sekvens?
CTD: (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) hepta peptid. Repeteras 52 ggr i humana RNA-polymeras II.
- Den ofosforylerade formen binder till preinitieringskomplexet.
- CTD forforyleras när transkription initieras.
- CTD defosforyleras efter transkriptionell terminering (hyperfosforylering).
Primärt RNA modifieras i eukaryoter.
En gen innehåller exoner och introner.
Vad är exon respektive intron?
Exon: Återfinns i det mogna RNA. Är kodande.
Intron: Redigeras bort när det mogna RNA bildas. Är icke-kodande.
Vilka är de 4 stegen i pre mRNA processen i eukaryoter?
1) 5´caping (sker samtidigt med transkription, 25nt)
2) Klyvning i poly (A) sätet (5´änden)
3) Polyadenylation i 3´ände (A sekvensen =60-250 nt)
4) splicing
Vad har Capping för funktion?
Skyddar mRNA från degradering samt har stimulerande effekter vid proteinsyntesen (translationen).
Vad har Poly (A) sekvensen för funktion?
Påverkar mRNA´s livslängd i cytosolen.
Förkortas så småningom när den är för kort bryts mRNA. PolyA-bindande proteinet (PABP) stimulerar nukleär translation och stabiliserar mRNA.
Hur säkerställer ribosomen att den arbetar på ett moget och intakt mRNA?
Closed-loop struktur:
5´-cap och Poly (A)-svansen i 3´änden samverkar för att stimulera translation. En closed-loop struktur bildas.
Beskriv kortfattat vad splicing innebär.
Man tar bort introner och klistrar ihop exoner. Det är lätt att hitta introner i våra celler mha sekvenser. I början av intron finns det en speciel sekvens som kallas 5´splice site. En annan sekvens märker slutet på intronsekvensen , en 3´splice site. Någonstans i mitten finns också branch site.
Felaktig splicing kan leda till sjukdom. Ge ex på en sådan sjukdom.
Talassemi:
En ärftlig sjukdom - abnormalt hb.
Blodkroppar blir mer känsliga för mekaniska skador. Skyddar mot malariasjukdom.
Man får anemi, förstorad lever och mjälte. Dålig tillväxt, benskörhet och hjärtsvikt.
Benmärg expanderar.
Orsakas av felaktig splicing. Det sker en mutation i introner så att man får en ny 5´splice site. –> man behåller en liten del av intronet i det mogna RNAt. Det är vanligt att man får en stopp-sekvens i introner.
Hur böjer man RNA?
Det finns sekvenser som böjer sig av sig själva. Splicing katalyseras av ett komplex med både snRNA och proteiner, spliceosomen väckar mRNA så att det väckas rätt.
Splicing - Hur går det till?
Först böjs mRNA så att det kommer i rätt position. Branch site med sitt 2´-fria OH kommer när fosfodiesterbindningen mellan exonet och 3´splice site och attackerar den och bryter den. Mellan greningspositionen och 5´ändan i intronet bildas fosfodiesterbindning.
Det fria exonet vrids och med sin 3´ände attackerar den andrafosfodiesterbindningen mellan intronet 3´splicesite och exonet –> två exoner binds samman och man får fritt intron. Lariatformen på intronet har hjälpt oss förstå hur det fungerar.
Vad är alternativ splicing?
En gen kan ge upphov till olika proteiner, Man kan välja att utelämna vissa exoner. Ordningen på exoner är dock alltid den samma.
Mutationer i alternativ splicing ger upphov till sjukdom, ge ett ex
cystisk fibros.
Vad är linking number?
Det antal ggr som en sträng i DNA vrider sig i höger riktning kring helixaxeln.
Om man har samma Lk för en kortare DNA-molekyl–> skapas topologisk stress. Det kallas positiva supercoils –> det skapas motstånd vilket gaffeln ej klarar av (bromsas).
Neg super coil =lätt att smälta
Pos super coil = mkt svår att smälta
