Prokaryot transkription och genreglering Flashcards
Vad har RNA-polymeras i prokaryoter för funktion?
- söker efter och binder till promotorer.
- kan upptvinna en kort sträcka på dubbelhelixen för att undanröja baserna som ska transkriberas.
- kan välja ribonukleosidtrifosfatet som motsvarar DNA-templaten och katalysera formationen av en fosfodiesterbindning.
- kan upptäcka terminationssignaler som avslutar transkriptionen.
- kan interagera med andra protein som reglerar uttrycket av genen, till exempel aktivatorer och repressorer
(RNA-polymeraser katalyserar den nukleofila attacken av 3’-hydroxylgruppen på sista nukleotiden i kedjan på α-fosfatgruppen på det inkommande nukleosidtrifosfatet. Det frisläpper PPi (i = inorganic). RNA-polymeraser behöver därför två Mg2+-joner vid det aktiva sätet.
RNA-syntes sker i transkriptionsbubblan, där ungefär 17 kvävebaser tvinnas upp.
Magnesiumjonerna hålls upp av asparaginsyra.)
Hur är ett E. Coli RNA-polymeras uppbyggt?
Ett E.coli RNA-polymeras består av fem olika subenheter: α2, β, β’, ω samt en sigmafaktor, σ. Sigmafaktorn hjälper till känna igen DNA:t. Det är ett stängt komplex.
β-subenheterna är ganska stora och enzymet är väldigt stort. De flesta enzymer är 200 aminosyror långa och några hundra kDa stora. Men eftersom RNA-polymeras har många funktioner måste enzymet vara komplext och stort.
Beskriv hur elongeringen i prokaryot transkription går till.
1: Ett ribonukleosidtrifosfat binder till den aktiva ytan i RNA-polymeraset, på motsatt sida av den växande RNA-kedjan.
2: Det inkommande ribonukleosidtrifosfatet bildar ett Watson-Crick baspar med mallsträngen.
3: 3’-hydroxylgruppen på den växande RNA-kedjan är orienterat och aktiverat av den hårt bundna metalljonen, och attackerar därför α-fosforylgruppen. Då bildas en ny fosfodiesterbindning, och förtränger pyrofosfatet.
4: RNA-DNA-hybriden rör sig relativt till polymeraset för att flytta 3’-änden på den precis tillagda nukleotiden till rätt position för tilläggning av nästa. Det kallas för translokation. Translokationen bryter inga bindningar mellan baspar och är irreversibel när den väl har utförts. Polymeriseringen drivs av klyvningen av trifosfat och frisläppandet av pyrofosfat.
RNA-polymeraser har en funktion där det kan backa bakåt för korrigering av felaktig basparning, hur går det till?
RNA-polymeraset kan också backa bakåt för att korrigera felplacera kvävebaser. Backningen är energetiskt ofördelaktig eftersom det krävs en brytning av bindningen mellan ett baspar . Eftersom själva basparningen är felaktig är dock energikostnaden där inte så hög.
När RNA-polymeraset har backat ligger fosfodiesterbindningen ett baspar innan den nyligen formade alldeles intill metalljonen i det aktiva sätet. Då sker hydrolys.
En vattenmolekyl attackerar fosfatet vilket resulterar i klyvningen av fosfodiesterbindningen och frisläppningen av dinukleotiden som innehåller den felaktiga nukleotiden.
Initiering av transkription; nämn viktiga faktorer.
Kärnenzym, holoenzym och sigmafaktorn
α2ββ’ω kallas för kärnenzymet. Inklusionen av sigmafaktorn producerar holoenzymet, med uppbyggnaden α2ββ’ωσ. σ-subenheten (sigmafaktorn) hjälper till att hitta platser på DNA:t där transkriptionen kan börja, det vill säga promotorer.
Vid promotorer deltar sigmafaktorn i initieringen av RNA-syntes och dissocierar sedan från enzymet.
RNA-polymeras som fäster sig på DNA:t. En sigmafaktor kan hjälpa till att känna igen promotorn. Därefter upptvinnas DNA:t och en transkriptionsbubbla bildas alldeles innan +1 och efter -10. När bubblan har bildats kan transkriptionsbubblan börja och då frisläpps sigmafaktorn. RNA-polymeraset skannar överallt.
Vart börjar transkriptionen?
Sekvenser uppströms om promotorn bestämmer var transkriptionen börjar. Två vanliga motiv återfinns uppströms om transkriptionens startplats: -10 sekvensen och -35 sekvensen. Regionen med dessa sekvenser kallas kärnpromotorn (core promotor). De båda sekvenserna är 6 baspar långa.
Genom analys av många promotorer har man kommit fram till att deras konsensussekvenser är TTGACA för -35 sekvensen och TATAAT för -10 sekvensen.
Beskriv sigmafaktorn och dess funktion
För att kärnenzymet ska binda promotorn krävs σ-subenheten. I närvaro av den kommer RNA-polymeraset att svagt binda till DNA:t och glida längs med dubbelhelixen tills den dissocieras eller stöter på en promotor. σ-subenheten känner igen promotorn genom växelverkan med promotor-DNA:ts kvävebaser. σ-subenheten interagerar med DNA:t vid -10 sekvensen och -35 sekvensen.
När den syntetiserade RNA-kedjan blir 9 eller 10 nukleotider i längd släpps σ-subenheten loss. Därefter kan den hjälpa ett annat kärnenzym med initiering.
E. coli har många olika sigmafaktorer för att känna igen olika typer av promotorsekvenser. Typen som känner igen konsensussekvensen kallas för σ70 eftersom den har en massa på 70 kDa. Om temperaturen ökar används en annan sigmafaktor, σ32 som känner igen promotorerna på gener för värmechock. Transkriptionen av värmechockgener ökar syntesen av skyddande proteiner. Andra sigmafaktorer kan svara på förhållanden i miljön, som kvävebrist.
σ är alltså viktigt för att bestämma var RNA-polymeraset ska initiera transkription.
Hur går terminering av transkription till?
En termineringssignal markerar slutet på elongationen.
Vid terminering slutar bildningen av fosfodiesterbindningar, RNA-DNA hybriden dissocierar, den upptvinnade delen av DNA:t återspolas och RNA-polymeraset släpper DNA:t.
De transkriberade delarna på DNA:t, alltså mallen (templaten) innehåller stoppsignaler.
Vissa gener uttrycks konstant och transkriberas hela tiden. De kallas för ———— gener. Andra gener uttrycks bara under vissa förhållanden, och är alltså föremål för ————.
Vissa gener uttrycks konstant och transkriberas hela tiden. De kallas för konstitutiva gener. Andra gener uttrycks bara under vissa förhållanden, och är alltså föremål för reglerat uttryck.
Vad avgör om en gen uttrycks eller inte?
Om en gen uttrycks eller inte är ett samspel mellan specifika DNA-sekvenser och särskilda proteiner som binder till dessa sekvenser. Oftast kommer proteinerna att undertrycka uttrycket av vissa gener genom att blockera tillgången till promotorerna för RNA-polymeraset. I vissa fall kan dock generna aktivera uttrycket av generna.
DNA-sekvenser själva är inte utmärkande och istället beror genreglering på andra sekvenser i genomet, regulatoriska sekvenser (reglerande sekvenser). De regulatoriska sekvenserna är uppströms om och nära generna. De igenkänns av DNA-bindande proteiner. Regulatoriska gener kodar för proteiner som interagerar med operatorn och promotorn.
Vad är operoner?
I operonmodellen ingår en regulatorisk gen som kodar för ett regulatoriskt protein, en reglerande DNA-sekvens som kallas för en operator samt strukturella gener.
Den regulatoriska genen kodar för en repressor som kommer att binda till operatorn. Då hindras transkription av de strukturella generna. Operatorn och dess associerade strukturella gener utgör operonet.
Vad är Lac-operonet?
I lac-operonet (laktos-operonet) finns tre gener som kommer att transkriberas till en enda mRNA-molekyl. Ett mRNA som kodar för mer än ett protein kallas för ett polygent eller polycistronisk transkript.
I avsaknaden av laktos är laktos-operonet undertryckt.
Vad är lac-repressorn?
Laktos-repressorn binder väldigt starkt och snabbt till operatorn i avsaknaden av laktos. När lac-repressorn (med helix-turn-helix motiv) är bundet till DNA hindrar den RNA-polymeras från att transkribera proteinkodande gener eftersom operatorn, där repressorn binder, ligger nedströms om promotorn. Lac-repressorn binder 4 ✕ 106 gånger starkare till operatorns DNA än till andra slumpmässiga platser. Den höga selektiviteten tillåter repressorn att hitta operatorn effektivt än med många andra potentiella platser i E. coli genom.
Det finns två platser på E. coli genomet vars sekvenser liknar operatorns sekvens. När en dimer DNA-bindande enhet på lac-repressorn binder till operatorn kan den andra binda till en av de liknande sekvenserna. DNA:t mellan de två bundna platserna bildar en loop.
Varje monomer av lac-repressorn består av en N-terminal domän som binder DNA och en större domän som medierar formationen av den dimera DNA-bindande enheten och tetrameren. Ett par av de N-terminala domänerna bildar tillsammans den funktionella DNA-bindande enheten. Varje monomer har en helix-turn-helix-enhet som interagerar med det bundna DNA:ts stora fåra.
Vad är allolaktos?
Allolaktos är en kombination av galaktos och glukos med en α-1,6-bindning snarare än α-1,4-bindning. Allolaktos är en inducerare av lac-operonet.
Vad är Attenuation?
Attenuation är ett sätt att reglera transkription genom modulering av RNA:s sekundärstrukturer.
