Reglering av genexpression

Question 1

Från DNA till protein:

Answer 1

Från DNA till protein:

DNA

Transkription, från DNA till mRNA

Post-transkriptionella modifieringarna intron klipps bort för att endast få exoner som är kodade gener.

Då kan mRNA gå till cytosolen

Sedan genomgås translationen i cytosolen

Protein

Question 2

Det finns många möjliga kontrollpunkter vid reglering av eukaryot expression

Answer 2

1. Transkription: Är den viktigaste kontrollpunkten. Transkription är viktigast hastighets begränsande steg, genom att den öker eller minkar för att kontrollera genexpression
2. RNA processering
3. Translation
4. Protein processering

Alla dessa steg kan regleras. Veckning av proteiner är ett viktigt steg inom post-transkriptionella modifieringar. Protein veckningen inkluderar även tillsatt av andra kemiska grupper, ko-enzymer såsom vitaminer

Klyvning av protein är också viktigt, för t.ex, insulin, som måste klyvs vid specifik kedja innan förekomsten av ett funktionellt protein.

T.ex: Ett pre-insulin bildas först, ej aktiv, då måste C-kedja klipps bort för att den ska aktiveras samt att 2 stycken Di-sulifid bindningar ska också bildas för insulin ska bli aktiv.

Hemofili A (blödarsjuka typ A) och hemofili B (blödarsjuka typ B) orsakas av brist på koagulationsfaktor 8. Dessa medfödda sjukdomar beror på mutationer lokaliserade på X-kromosomen och drabbar därför huvudsakligen pojkar/män.

Question 3

Reglering på gen-nivå
Olika sätt att reglera enzymer

Answer 3

Reglering på gen-nivå (effekt på genen)

En promotor, där sitter sekvenser som kodar för reglerande proteiner, dessa är viktiga för att reglera transkription och dess hastighet
Promotor är en styrsekvens

Enzym system och dess bildnings hastighet är därför viktigt som styr konc. av LM och dess effekt

Enzymer kan regleras på enzym nivå, genom allosteriska och kovalenta modifieringar.

Men även genexpressionen kan regleras, där antal enzym molekyler kan regleras.

Transkription ökar, mer mRNA, mer protein

Question 4

Gen och enzym

Answer 4

Läkemedel kan, genom ett LM metaboliserande enzym, blir till en vattenlöslig läkemedelsmetabolit (kan utsöndras)

CYP350 eller flera stycken reaktionen kräver för att få LM metabolit

Bakom varje enzym finns det en gen, som kodar för detta enzym, för att enzymer är protein, det krävs gen expression

Reglering av enzymatisk katalys kan vara antingen på enzym-nivå eller gen-nivå

Question 5

Om LM metaboliserande enzymet hämmas

Answer 5

Att det LM metaboliserande enzymet hämmas, bildas enzymet inte lika fort, vilket leder att mindre andel av LM:et kommer att metaboliseras och övergå till den vattenlösliga läkemedelsmetaboliten. Vilket leder att vi får mer LM än LM metabolit.

Question 6

Om LM metaboliserande enzymet stimuleras

Answer 6

Medan med en stimulator, jobbar enzymet snabbare. Stimulator är vanliga och då får man lägre LM konc. Och högre LM metabolit.

Men det finns LM som är prodrug, så att LM metaboliten är det som är aktiv och inte LM.

Question 6

Om LM metaboliserande enzymet stimuleras

Answer 6

Medan med en stimulator, jobbar enzymet snabbare. Stimulator är vanliga och då får man lägre LM konc. Och högre LM metabolit.

Men det finns LM som är prodrug, så att LM metaboliten är det som är aktiv och inte LM.

Question 7

Repressor

Answer 7

Repressor, ett protein som binder till specifika regioner på DNAt. Detta hämmar transkriptionen av närliggande gener genom flera mekanismer. Repressorer kan också stöta bort aktivatorer.

Detta medför alltså att genexpressionen minskar (Särskilt transkriptionen), vilket leder att mindre enzym molekyler bildas. Att metabolisera LM till LM metabolit går därför långsammare. Vilket leder att LM konc. ökar.

Question 8

Aktivator

Answer 8

Aktivator (Inducerare) är proteiner som binder till DNA:t, samt rekryterar de generella transkriptionsfaktorerna som behövs för att starta transkriptionen av gener till RNA.

De leder alltså till att transkriptionen ökar, vilket LM konc. sjunker, medan LM metabolit ökar.

Detta kan ha stora konsekvenser

P-piller, får interaktion med johannesört, som leder till att p-pillers konc. blir för låg, detta leder till oplanerad graviditet.

Question 9

Transkription och komplex av proteiner
JJJ

Answer 9

För start av transkription behövs ett komplex av proteiner och regulatorer som interagerar

Promotor är där reglerande proteiner ska binda.

Promotor är inte som en rak sträck, denna är istället ligger uppströms om translationsstarten, som ett J.

Komplex av proteiner och regulatorer sitter fast bara när transkriptionen ska påverkas.

Question 10

Mediator komplex

Enhancer sekvenser

TATA-box

Answer 10

Mediator komplex är ett proteinkomplex som består av ett flertal olika subenheter. Dess funktion är att reglera transkriptionsfrekvensen av olika gener. Det reglerar även funktionella komponenter för transkription, såsom RNA-polymeraser, som behövs för att genomföra transkriptionen.

Enhancer sekvenser: Cis-verkande DNA-sekvenser med förmåga att öka geners transkriptionskapacitet. Förstärkarna verkar vanligtvis både uppströms och nedströms och på olika avstånd från en promoter.

TATA-box är en promotor-sekvens som är en region rik på adenin och tymin som utgör startpunkt för RNA-polymeras vid transkription. TATA-boxen är placerad ca 25 baspar uppströms från transkriptionsstart.

Regulatoriska transkriptionsfaktorer binder oftast till DNA:t längre uppströms från den gen i vars reglering de är involverade i.

Question 11

Leucin

Answer 11

Leucin regionen består i allmänhet av 60-80 aminosyror som bildar två subenheter som vardera består av två α-helixar som bildar dels en evolutionärt mycket bevarad region som allmänt binder till DNA och en betydligt mer varierande region med sekvensspecifik bindning.

Question 12

Transkriptionsfaktorer

Answer 12

Transkriptionsfaktorer är:

*Reglerande proteiner som påverkar gen-transkription

*Kan vara generella (påverkar många olika gener) eller specifika (effekt på en eller mindre antal gener)

*En del transkriptionsfaktorer stimulerar medan andra hämmar transkription

Question 13

Olika sätt att aktivera transkriptionsfaktorer

Answer 13

*Transkriptionsfaktorer kan aktiveras av signaler från olika håll (Sätt att överföra signalen):

• från ämnen inuti cellen (ex i cellkärna eller cytosol)
• från ämnen utanför cellen via receptorer i cellmembranet
• från ämnen som kommer in i cellen och binder till intracellulära receptorer

En signal som ska styra transkription kan vara en intracellulär signal molekyl, i orange, som kan direkt komma in i cellkärnan.

En signal kan även vara en extracellulär signal molekyl som kommer utanför, röda extracellulär, kommer aldrig i cellen, den binder till membran RC som skickar vidare signalen till transkriptionsfaktor som påverkar transkription i cellkärnan.

Mörkgrönt, binder till extracellulär signal molekyl som binder till intracellulär RC.

Hela komplexet av mörkgrön och svart kan komma in i cellkärnan och fungera som transkriptionsfaktor

Question 14

Transkriptionsfaktorer är oftast uppbyggda av två delar

Answer 14

Transkriptionsfaktorer är oftast uppbyggda av två delar:

1) en ligand-bindande del (LBD) där signalmolekyler kan binda

2) en DNA-bindande del (DBD) som interagerar med DNA, för att transkriptionsfaktor ska binda till sekvenser i promotor

Det finns också ligand-oberoende transkriptionsfaktorer

Question 15

Några ligand-styrda transkriptionsfaktorer = RC

Answer 15

Några ligand-styrda transkriptionsfaktorer av betydelse för läkemedelsnivåerna i kroppen, de har betydelse för LM konc. biverkningar och LM utveckling:

• PXR (pregnane X receptor):
• CAR (constitutive androstane receptor):
• Ah-receptorn (aryl hydrocarbon receptor, AHR):

Question 16

Nukleära RC

Answer 16

Andra nukleära receptorer, såsom CAR och PXR som uppreglerar uttrycket av cytokrom P450-enzymer som metaboliserar olika LM.

Nukleära RC är:

• en typ av ligand-beroende transkriptionsfaktorer
• aktivering av ligand leder ofta till förflyttning inom cellen
• har sin effekt i cellkärnan (nucleus). Man trodde att RC alltid finns i kärnan, men de kan vara på andra ställen, men om de ska kontrollera transkriptionen och verka då ska de vara i kärnan. (Mörkgrön)
• inblandade i regleringsmekanismer som påverkas av:
• steroidhormoner (t ex östrogener och androgener)

och

• läkemedel

Nukleära receptorer består av DBD och LBD.

Question 17

Hur aktiveras nukeulära RC?

Answer 17

Nukleära receptorer påverkar transkriptionshastigheten via effekt på genens promotor

➤ (Vanligaste) Att nukleära RC binder ofta direkt till genens promotor vid speciella igenkänningssekvenser s k: ”response element” (specifika för varje receptor), PXR har en viss response element, medan CAR har en annan.

➤ kan också påverka genen indirekt, de binder inte till DNA, där

Ligand binder till receptor

Ligand-receptorkomplex (receptorns struktur förändras), ofta skapas homo- eller hetero dimerer. Dimerer: när två stycken RC har slagits ihop och leder till omlokalisering.

Omlokalisering av receptorkomplexet, leder till effekt på gen

Kodande DNA med promotor, då kan en nukleära RC binda till en signal molekyl (Ligand).

Att signal molekylen binder leder till att RC blir aktiverad. Den hittar då ett den aktiverade RC med signal molekylen binder till en specifik respons element i DNA. En annan RC kan skapa dimerar, med den RC i frågan, då kan den andra binda vid sidan av, de jobbar därför ihop.

Response element är korta sekvenser av DNA inom en genpromotor kan binda specifika transkriptionsfaktorer och reglera transkription av gener.

Heterodimer: När de är olika

Homodimerer: När de är lika

Monomerer: Jobbar ensamt

Oftast fungerar det på det sättet, så att den ena RC har en ligand men inte det andra, och detta är vanligt, där den ena RC har bunden ligand, men inte den andra.

Question 18

Aktivering av NU RC i närvaro av aktivator

Answer 18

Bilden visar aktiveringen av nukleära RC. Där ett hormon diffunderar genom cellmembranet kan binda till den nukleära RC.

När hormonet binder till den nukleära RC, blir den aktiverad, vilket leder att andra sammanhängde proteiner lossnar.

Den nukleära RC och dess ligand, skapar en homodimer med en samma nukleära RC. Detta leder till en effekt på transkription. Vid detta fall, leder till högre transkriptions grad, detta beror på att i bilden har vi en coaktivator. Detta i sin tur leder till mer mRNA och mer protein syntes, vilket kan ändra cellens funktion.

Question 19

PXR

Answer 19

PXR, är en nukleär receptor:

☞ många olika kroppsfrämmande ämnen, bl a flera läkemedel (LM) är ligander för PXR.

☞ PXR behöver en annan receptor som hetero-dimer partner: RXR (retinoid X receptor). Tillsammans bildar ett par och fungerar som transkriptionsfaktor.

☞ PXR/RXR inducerar många viktiga LM-metaboliserande enzymer

Question 20

RXR

Answer 20

• RXR inducerar ÄVEN gener som kodar för LM-transportörer, som transportera ämnen över membran.

Transport proteiner sitter på ett membran, som kan vara njurens, tarmens eller en annan vävnad. Transport proteiner har funktionen att transportera LM till andra änden av membranet.

Ett transport protein är ett protein som bildas av en gen, därför kan vi reglera uttrycket av transport proteiner och ändra LM fördelning i kroppen och LM konc.

• att testa effekter av läkemedelskandidater på PXR är viktigt vid LM-utveckling tidigt vid LM utvecklingen, för att (Se sista punkten)
• ett LM kan inducera PXR och därigenom påverka koncentrationen av andra LM kan leda till LM-interaktioner

PXR är den viktigaste RC för att den påverka LM konc.

Det är viktigt att testa aktiveringen av olika transkriptionsfaktorer, man använder sig, under LM utveckling, av cell kulturer, som liknar leverceller eller tarmceller, som är viktiga organ för LM metabolism.

Eller genmodifierande djur, där PXR som tillhör en mus, har humant version av PXR.

Man kombinerar alltså olika metoder under LM utveckling för att testa LM interaktioner.

Man tillsätter något till PXR som lätt kan mätas.

Question 21

PXR aktivering

Answer 21

PXR aktiverar gener. En PXR ligand (Ett LM t.ex), kommer in i cellen och binder till PXR.

PXR blir aktiverad och bildar en hetrodimer med RXR (Endast PXR är bunden till ligand). Tillsammans, hetrodimernana kommer in i cellkärnan och binder till response element, som vid detta fall är ER6,

PXR har ligand, men inte RXR, detta sker inte alltid

RXR är viktigt för att PXR ska aktiveras

Aktivering leder till transkription ökar, CYP3A ökar och kan metabolisera den liganden (LM) som metaboliseras av CYP3A.

PXR kan ha främmande ämne som ligand, men även kroppsegna ämnen

Question 22

CAR

Answer 22

CAR är nukleära RC, har likande mekanism med PXR

CAR (constitutive androstane receptor)

• reglerar genexpression av ett stort antal läkemedels metaboliserande enzymer
• många ämnen som aktiverar PXR aktiverar också CAR
• CAR kan ibland även vara aktiv utan ligand, men bindning av olika ämnen kan öka eller minska dess aktivitet
• fungerar som monomer (Ensam molekyl) eller heterodimer med RXR (En CAR och en RXR RC)

Question 23

Ah-receptorn

Answer 23

Ah-receptorn (aryl hydrocarbon receptor), reagerar på många gifter, som miljö gifter men även LM

• aktiveras av liganden som försvar på giftiga ämnen som kommer till kroppen. Alltså aktiveras av polycykliska kolväten och dioxiner (tobaksrök, bilavgaser, miljöföroreningar) men även av vissa LM
• i sin inaktiva form bunden till cytosolära chaperon-proteiner. Ah-RC brukade inte räknas som en nukleär RC för att man har länge känt till att Ah-RC, finns i cytosolen när den är inaktiv, men nu vet man att i sin icke-aktiva form kan nukleära RC finns någon annan stans än cellkärnan.
• aktivering leder till transport in i cellkärnan där Ah-receptorn reglerar transkription i komplex med ett annat protein, nämligen ARNT
• Aktivering av Ah-RC inducerar bl.a enzymer som metaboliserar många giftiga Ah-receptor ligander (del av kroppens respons på främmande ämnen) MEN leder ofta till ännu giftigare metaboliter.

Question 24

Ah- Aktivering

Answer 24

AHR ligand binder till Ah-RC, vilket leder till att Ah RC lossnar från de sammanbundna proteiner. Ah-RC tillsammans med liganden kommer in i cellkärnan och binder till ARNT.

Tillsammans, Ah-RC och ARNT binder till respons element, inte samma respons element som PXR, i detta fall är det XRE.

Transkriptionen ökar, vilket leder att uttryck av CYP1-enzymer ökar, de kan bryta ner LM.

Question 25

Co-aktivator

Co-repressor

Answer 25

Men det finns även andra proteiner som hjälp-molekyler som är inblandande:
Co-aktivator: är en typ av transkriptionell koregulator som binder till en aktivator för att öka transkriptionshastigheten för en gen.

Co-repressor: är en molekyl som undertrycker uttrycket av gener. En co-repressor binder inte direkt till DNA, utan reglerar istället indirekt genuttryck genom att binda till repressorer.

Question 26

LM interaktioner, två typer

Answer 26

LM interaktioner, två typer:
Effekt på enzym-nivå: Ett enzym kan omvandla LM till ett LM metabolit. Man tar ett LM, som bryts av ett visst enzym. Men om man intar ett annat LM som bryts ner av samma enzym, så har enzymet dubbelt så mycket att göra, det kan gå långsammare.

Substanser kan också påverkas enzymet, genom att enzymet hämmas, då går LM inte att brytas ner lika fort.

Effekt på gen-nivå: Vissa läkemedelsinteraktioner beror på aktivering av PXR.
Ett LM som aktiverar PXR kan öka metabolismen även av andra läkemedel, för att den ökar uppreglering av enzymet, de bryts ner därför fortare.

Question 27

LM interaktioner

Answer 27

Ett LM A aktiverar PXR, vilket leder till en ökad transkription av CYP3A exempelvis.

Detta leder att många LM som bryts ner av CYP3A kan bryts ner snabbt utan att ge effekt.

Om man tar Viagra med Grapefrukt, kan man få hjärtinfarkt, för att det finns ett enzym hämmare i Grape frukt, som hämmar enzymet som bryter ner Viagra, vilket leder till högre koncentration Viagra i blodet.

I frukten finns ett ämne som hindrar läkemedlet från att brytas ned.Det finns risk att blodet koagulerar och att man får ett ständigt stånd.

Grapefrukt har den effekten att det höjer koncentrationen av ett läkemedel

Det finns flera inrapporterade fall där kvinnor blivit gravida fastän de ätit p-piller. I flera fall har man kunna konstaterat att de ätit just johannesört

Induktion av PXR, genom P-pillar och johannesört, oplanerad graviditet, detta kan vara riskabelt,

Medan grapefrukten verkar som om du hade tagit dubbel dos medicin, gör johannesörten att effekten av läkemedlet kan försvinna helt.

Warfarin, är ett ämne som förhindrar blodkoagulering, vilket leder till tunnare blod, men inte för tunt blod, det är därför viktigt att inte ha för mycket eller för lite Warfarin, man ska därför undvika vissa LM om man tar Warfarin.