Metodik inom forskning och LM-utveckling Flashcards
Molekylära biologiska metoder
Molekylära biologiska metoder: Metoder som används för att undersöka eller påverka makromolekyler i cellen. Makromolekylers som har med genexpression att göra, som är DNA, mRNA och protein.
DNA: (Undersöka)
DNA sekvensering: Genom metoden får man info om nukleotidernas ordning
Kloning av DNA med hjälp av bakterier
Kloning av DNA med hjälp av PCR.
RNA: (Undersöka)
PCR kan också används för att mäta mRNA:s mängd för att få veta hur mycket protein ska bildas
Uttryck av mRNA med hjälp av PCR.
Uttryck av många gener med hjälp av microarray
Protein: (Undersöka)
Western blotting: Hur mycket?
Immunhistokemi: Man använder vävnadsprov. Man kollar var har vi protein?
DNA (Påverka):
Knock out / knock in med hjälp av Crisper cas9: Man kan förändra ett gen på ett specifikt sätt. Detta är en permanent förändring för att det är på DNA nivå
RNA (Påverka):
Knock down med siRNA, detta är icke-permanent, med hjälp av den kan vi bestämma mängden nybildade protein.
PCR - Allmänt och användingsområde
PCR förökar DNA i ett provrör
PCR = Polymerase Chain Reaction. En metod för att klona DNA.
Snabbare metod (än bakteriell kloning) - ENDAST OM sekvensen är känd, början och slutet på sekvensen måste vara känd.
Känslig, snabb och enkel metod för att amplifiera/kopiera/föröka
Känslig, då det behövs lite utgångspunkt. Då den kräver endast kortare DNA-fragment (<10 000 bp)
PCR Användningsområde:
- DNA-kloning
- Diagnostik, för att den är känslig och kräver små mängd DNA
- Kriminalteknik: Man jämför sekvenser som varierar mellan olika individer.
- Kvantitativa molekylärbiologiska metoder (t ex bestämma genuttryck): Bestämma mängden.
Vad behövs för en PCR-reaktion?
Vad behövs för en PCR-reaktion?
- Primers = enkelsträngade oligonukleotider.
- 17-20 baser
- Komplementära till 3’-ändarna på det DNA-fragment man vill föröka/amplifiera
- Utgör startpunkt för amplifiering
- Avgör vilken bit av DNA:t som förökas - specificitet! - Värmetåligt DNA-polymeras: Är detta polymeras som utför kopiering. Måste vara värmetåligt, de tas därför från en bakterier som trivs vid höga temperaturer vid vulkaner
- Taq-polymeras, från bakterien Thermus aquaticus - Överskott av byggstenar till DNA
- Programmerbart värmeblock: Som kan justera värmen i en block.
- DNA vi vill föröka.
Hur går PCR reaktionen till?
DNA sekvens som ska amplifieras
All krävda material (Slide 4) tillsätts i ett provrör i värmeblocket
Denaturering: Första steg. Man hettar upp provet, DNA molekylen denaturerar, strängarna separeras från varandra och blir enkelsträngade. Vid 95°C. Anledningen till att vi inte kan använda vårt humana polymeras, är att vid 95°C skulle det ha denatureras.
Annealing: 50-60°C, här binder primerna in till den DNA sekvensen de är komplementära emot. För att primerna ska kunna hybridiseras och bilda vätebindningarna, måste man sänka temperaturen.
DNA polymerisering: Här sker själva kopiering vid 72°C, där den tar primer som utgångspunkt, och därefter skapar den en kopia av DNA.
Vi har programbara block för att underlätta mätningen samt att ej behöva ändra temperatur för varje steg.
Antal cyklar PCR
30 cykler –> 130 miljoner nya DNA-molekyler
Från ng utgångsmaterial till μg produkt
Cykeln repareras 30-40 gånger
Vid första cykel har vi 2 DNA-molekyler
Vid andra cykel har vi 4 DNA-molekyler
Vid tredje cykel har vi 8 DNA-molekyler
Gelelektrofores
PCR-produkten analyseras/renas med gelelektrofores
Gelelektrofores: Elektrofores ger möjlighet att uppskatta storleken på PCR produkten. Elektrofores avslöjar även oönskade amplifierings produkter om de finns.
Fragmentet kommer att vandra genom gelen mha elektrisk spänning som sker en separering med avseende på storlek. Ju kortare DNA fragment är desto kommer längre in.
Man undersöker om:
Har jag fått den PCR-produkt jag förväntade mig (rätt storlek)?
Fanns det jag letade efter i DNA-provet? T.ex virus.
Vi har en agarose gel med brunnar i, där man kan pipettera lösningen i.
PCR lösningen pipetteras i den (-) polen av gelelektroforesen, DNA migrerar mot (+) polen. För att DNA är negativ laddad.
Ju kortare baspar de är desto längre kommer dem.
Realtids-PCR
Ju fler cyklar på x axel desto mer flourescens.
Realtids-PCR (qPCR) ger mått på mängd PCR-produkt ”i farten”
Fluorescerande markör läggs till PCR-produkten i varje cykel –> fluorescensen ökar exponentiellt med antal cykler
Realtids-PRC kan man mäta mängden PCR produkt efter varje cykel. Man lägger en fluorescerande markör
Ju fler cyklar, desto mer fluorescens.
Tröskelvärdet bestäms av laboranten.
Genom att jämföra röda med blåa cykel kan man bestämma att:
Den röda grafen har högre grad infektion för att den når tröskelvärdet tidigare än den blåa, den kräver alltså mindre antal cyklar för att komma upp till tröskelvärdet.
Från blodprov till resultat
PCR kan användas för att hitta små DNA-spår inom:
Kriminalteknik
- Små mängder blod eller annan vävnad –> DNA-fingeravtryck
Identifiera mikroorganismer, såsom virus
- Känsligheten –> några få molekyler av t.ex. ett virus kan upptäckas i blod
Steg för att upptäcka virus hos en patient:
Blodprov tas fram från en person som misstänks vara infekterad
Celler tas bort genom centrifugering
Viruspartiklar befinner sig i plasma hos den infekterade personen. Därför är det endast plasma som undersökas.
DNA extraheras
PCR cyklar inträffar för att amplifiera virus DNA
Kontroll med blod från en icke-infekterad person med gelelektrofes.
Primers är det som gör att de specifika för bara virus DNA och inte vårt humana DNA, då det är de som avgör specificitet.
Tester på apotek
PCR kan också används för att undersöka sina genetiska förutsättningar
Dynamic code – Hem tester att köpa på apotek
Kindgnuggsprov –> DNA –> PCR-analys –> svar
De genetiska förändringar testet är SNP-beroende
SNP = En punktmutationer
Exempel på tester:
- Laktosintolerans: Där man har SNP i laktas
- SNP i laktasgenen - Skydd mot vinterkräksjuka?
- SNP i FUT2 - Klassificering av muskelegenskaper
- variant av ACTN3, om man har tung eller lätt muskel.
PCR för att mäta genuttryck
PCR kan också användas för att mäta genuttryck
Hur mycket RNA som uttrycks från en gen bestämmer mängd protein som kommer förmodligen att bildas,
Genom att mäta mängd RNA kan man räkna ut hur mycket protein bildas
Gen A: Kodar för fler antal mRNA, som i sin tur leder till större mängd protein.
Gen B: Kodar för mindre antal mRNA, som i sin tur leder till mindre mängd protein.
DNA –Transkription–> mRNA –Translation–> Protein
Från mRNA till analys
- Isolera mRNA från prov som vi vill undersöka
- RNA:at används för att tillverka cDNA med hjälp av omvänt transkriptas, som använder mRNA som mall för att cDNA. Omvänt transkriptas kan alltså transformerar mRNA till DNA.
- Utför PCR-reaktion med primers, specifika för genen vars uttryck ska bestämmas.
- Analysera PCR-produkten med hjälp av t.ex. gelelektrofores
* Mängd PCR-produkt är proportionell mot mängden cDNA som är proportionell mot mRNA i provet. Som är proportionell mot protein
Microarrays - Allmänt
Microarrays kan mäta uttrycket av flera gener samtidigt
Gör det möjligt att undersöka transkriptomet
Gener - mRNA - protein – fenotyp
Alla protein i en cell avgör fenotyp i en cell
Microrrays används vid diagnosering av bröstcancer
Hur går Microarrays?
Hur går Microarrays?
- Isolering av mRNA från olika prover
- Omvänd transkription från mRNA till cDNA + märkning med fluorescens
- cDNA får hybridisera med DNA-fragment (1000-tals) bundna på microarray platta
Plattan har små brunnar som varje brunn finns det enkelsträngade Oligonukleotid, varje brunn representerar en gen. cDNA låtar man hybridisera med Oligonukleotid.
- Scanna med fluorescensdetekor
- Fluorescensmärkningen —> möjligt att se var hybridisering skett
- Högre intensitet = fler transkript, fler mRNA - Analysera data mha bioinformatik
Western Blotting
Proteinuttryck kan mätas med hjälp av Western Blotting
- Isolera protein
- Separera proteinerna efter storlek med hjälp av gelelektrofores
- Överför (blotta) proteinerna från gelen till ett membran. Vi får en papperskopia av gelelektrofores
- Inkubera membranet med primär antikropp mot proteinet
- Inkubera membranet med sekundär antikropp mot primära
- Detektera signal, genom att den antingen fluoresceras eller vara bunden till ett enzym som kan underlätta dess detektion.
Om vi har lite protein, kommer mindre ljus att synas.
Primära antikroppen är det som avgör specificitet
Primära binder till proteinet och sekundära binder till det primära
Den sekundära är specifik för den primära
Immunohistokemi
Immunohistokemi: Liknande Western Blotting, men utförs i intakta celler/vävnader –> möjligt att se var proteinet finns med hjälp av mikroskop
