Metodik inom forskning och LM-utveckling Flashcards
Molekylära biologiska metoder
Molekylära biologiska metoder: Metoder som används för att undersöka eller påverka makromolekyler i cellen. Makromolekylers som har med genexpression att göra, som är DNA, mRNA och protein.
DNA: (Undersöka)
DNA sekvensering: Genom metoden får man info om nukleotidernas ordning
Kloning av DNA med hjälp av bakterier
Kloning av DNA med hjälp av PCR.
RNA: (Undersöka)
PCR kan också används för att mäta mRNA:s mängd för att få veta hur mycket protein ska bildas
Uttryck av mRNA med hjälp av PCR.
Uttryck av många gener med hjälp av microarray
Protein: (Undersöka)
Western blotting: Hur mycket?
Immunhistokemi: Man använder vävnadsprov. Man kollar var har vi protein?
DNA (Påverka):
Knock out / knock in med hjälp av Crisper cas9: Man kan förändra ett gen på ett specifikt sätt. Detta är en permanent förändring för att det är på DNA nivå
RNA (Påverka):
Knock down med siRNA, detta är icke-permanent, med hjälp av den kan vi bestämma mängden nybildade protein.
PCR - Allmänt och användingsområde
PCR förökar DNA i ett provrör
PCR = Polymerase Chain Reaction. En metod för att klona DNA.
Snabbare metod (än bakteriell kloning) - ENDAST OM sekvensen är känd, början och slutet på sekvensen måste vara känd.
Känslig, snabb och enkel metod för att amplifiera/kopiera/föröka
Känslig, då det behövs lite utgångspunkt. Då den kräver endast kortare DNA-fragment (<10 000 bp)
PCR Användningsområde:
- DNA-kloning
- Diagnostik, för att den är känslig och kräver små mängd DNA
- Kriminalteknik: Man jämför sekvenser som varierar mellan olika individer.
- Kvantitativa molekylärbiologiska metoder (t ex bestämma genuttryck): Bestämma mängden.
Vad behövs för en PCR-reaktion?
Vad behövs för en PCR-reaktion?
- Primers = enkelsträngade oligonukleotider.
- 17-20 baser
- Komplementära till 3’-ändarna på det DNA-fragment man vill föröka/amplifiera
- Utgör startpunkt för amplifiering
- Avgör vilken bit av DNA:t som förökas - specificitet! - Värmetåligt DNA-polymeras: Är detta polymeras som utför kopiering. Måste vara värmetåligt, de tas därför från en bakterier som trivs vid höga temperaturer vid vulkaner
- Taq-polymeras, från bakterien Thermus aquaticus - Överskott av byggstenar till DNA
- Programmerbart värmeblock: Som kan justera värmen i en block.
- DNA vi vill föröka.
Hur går PCR reaktionen till?
DNA sekvens som ska amplifieras
All krävda material (Slide 4) tillsätts i ett provrör i värmeblocket
Denaturering: Första steg. Man hettar upp provet, DNA molekylen denaturerar, strängarna separeras från varandra och blir enkelsträngade. Vid 95°C. Anledningen till att vi inte kan använda vårt humana polymeras, är att vid 95°C skulle det ha denatureras.
Annealing: 50-60°C, här binder primerna in till den DNA sekvensen de är komplementära emot. För att primerna ska kunna hybridiseras och bilda vätebindningarna, måste man sänka temperaturen.
DNA polymerisering: Här sker själva kopiering vid 72°C, där den tar primer som utgångspunkt, och därefter skapar den en kopia av DNA.
Vi har programbara block för att underlätta mätningen samt att ej behöva ändra temperatur för varje steg.
Antal cyklar PCR
30 cykler –> 130 miljoner nya DNA-molekyler
Från ng utgångsmaterial till μg produkt
Cykeln repareras 30-40 gånger
Vid första cykel har vi 2 DNA-molekyler
Vid andra cykel har vi 4 DNA-molekyler
Vid tredje cykel har vi 8 DNA-molekyler
Gelelektrofores
PCR-produkten analyseras/renas med gelelektrofores
Gelelektrofores: Elektrofores ger möjlighet att uppskatta storleken på PCR produkten. Elektrofores avslöjar även oönskade amplifierings produkter om de finns.
Fragmentet kommer att vandra genom gelen mha elektrisk spänning som sker en separering med avseende på storlek. Ju kortare DNA fragment är desto kommer längre in.
Man undersöker om:
Har jag fått den PCR-produkt jag förväntade mig (rätt storlek)?
Fanns det jag letade efter i DNA-provet? T.ex virus.
Vi har en agarose gel med brunnar i, där man kan pipettera lösningen i.
PCR lösningen pipetteras i den (-) polen av gelelektroforesen, DNA migrerar mot (+) polen. För att DNA är negativ laddad.
Ju kortare baspar de är desto längre kommer dem.
Realtids-PCR
Ju fler cyklar på x axel desto mer flourescens.
Realtids-PCR (qPCR) ger mått på mängd PCR-produkt ”i farten”
Fluorescerande markör läggs till PCR-produkten i varje cykel –> fluorescensen ökar exponentiellt med antal cykler
Realtids-PRC kan man mäta mängden PCR produkt efter varje cykel. Man lägger en fluorescerande markör
Ju fler cyklar, desto mer fluorescens.
Tröskelvärdet bestäms av laboranten.
Genom att jämföra röda med blåa cykel kan man bestämma att:
Den röda grafen har högre grad infektion för att den når tröskelvärdet tidigare än den blåa, den kräver alltså mindre antal cyklar för att komma upp till tröskelvärdet.
Från blodprov till resultat
PCR kan användas för att hitta små DNA-spår inom:
Kriminalteknik
- Små mängder blod eller annan vävnad –> DNA-fingeravtryck
Identifiera mikroorganismer, såsom virus
- Känsligheten –> några få molekyler av t.ex. ett virus kan upptäckas i blod
Steg för att upptäcka virus hos en patient:
Blodprov tas fram från en person som misstänks vara infekterad
Celler tas bort genom centrifugering
Viruspartiklar befinner sig i plasma hos den infekterade personen. Därför är det endast plasma som undersökas.
DNA extraheras
PCR cyklar inträffar för att amplifiera virus DNA
Kontroll med blod från en icke-infekterad person med gelelektrofes.
Primers är det som gör att de specifika för bara virus DNA och inte vårt humana DNA, då det är de som avgör specificitet.
Tester på apotek
PCR kan också används för att undersöka sina genetiska förutsättningar
Dynamic code – Hem tester att köpa på apotek
Kindgnuggsprov –> DNA –> PCR-analys –> svar
De genetiska förändringar testet är SNP-beroende
SNP = En punktmutationer
Exempel på tester:
- Laktosintolerans: Där man har SNP i laktas
- SNP i laktasgenen - Skydd mot vinterkräksjuka?
- SNP i FUT2 - Klassificering av muskelegenskaper
- variant av ACTN3, om man har tung eller lätt muskel.
PCR för att mäta genuttryck
PCR kan också användas för att mäta genuttryck
Hur mycket RNA som uttrycks från en gen bestämmer mängd protein som kommer förmodligen att bildas,
Genom att mäta mängd RNA kan man räkna ut hur mycket protein bildas
Gen A: Kodar för fler antal mRNA, som i sin tur leder till större mängd protein.
Gen B: Kodar för mindre antal mRNA, som i sin tur leder till mindre mängd protein.
DNA –Transkription–> mRNA –Translation–> Protein
Från mRNA till analys
- Isolera mRNA från prov som vi vill undersöka
- RNA:at används för att tillverka cDNA med hjälp av omvänt transkriptas, som använder mRNA som mall för att cDNA. Omvänt transkriptas kan alltså transformerar mRNA till DNA.
- Utför PCR-reaktion med primers, specifika för genen vars uttryck ska bestämmas.
- Analysera PCR-produkten med hjälp av t.ex. gelelektrofores
* Mängd PCR-produkt är proportionell mot mängden cDNA som är proportionell mot mRNA i provet. Som är proportionell mot protein
Microarrays - Allmänt
Microarrays kan mäta uttrycket av flera gener samtidigt
Gör det möjligt att undersöka transkriptomet
Gener - mRNA - protein – fenotyp
Alla protein i en cell avgör fenotyp i en cell
Microrrays används vid diagnosering av bröstcancer
Hur går Microarrays?
Hur går Microarrays?
- Isolering av mRNA från olika prover
- Omvänd transkription från mRNA till cDNA + märkning med fluorescens
- cDNA får hybridisera med DNA-fragment (1000-tals) bundna på microarray platta
Plattan har små brunnar som varje brunn finns det enkelsträngade Oligonukleotid, varje brunn representerar en gen. cDNA låtar man hybridisera med Oligonukleotid.
- Scanna med fluorescensdetekor
- Fluorescensmärkningen —> möjligt att se var hybridisering skett
- Högre intensitet = fler transkript, fler mRNA - Analysera data mha bioinformatik
Western Blotting
Proteinuttryck kan mätas med hjälp av Western Blotting
- Isolera protein
- Separera proteinerna efter storlek med hjälp av gelelektrofores
- Överför (blotta) proteinerna från gelen till ett membran. Vi får en papperskopia av gelelektrofores
- Inkubera membranet med primär antikropp mot proteinet
- Inkubera membranet med sekundär antikropp mot primära
- Detektera signal, genom att den antingen fluoresceras eller vara bunden till ett enzym som kan underlätta dess detektion.
Om vi har lite protein, kommer mindre ljus att synas.
Primära antikroppen är det som avgör specificitet
Primära binder till proteinet och sekundära binder till det primära
Den sekundära är specifik för den primära
Immunohistokemi
Immunohistokemi: Liknande Western Blotting, men utförs i intakta celler/vävnader –> möjligt att se var proteinet finns med hjälp av mikroskop
RNAi kan tillfälligt hämma uttrycket av en gen
RNAi kan tillfälligt hämma uttrycket av en gen
- Används för att studera funktionen hos visst protein, vi tar bort uttrycket av ett protein och kolla vilken funktion försvann
- Uråldrigt skydd mot dsRNA-virus som utnyttjas
- På labb: siRNA ser till att vissa mRNA bryts ner –> inget protein
- siRNA komplementärt till det mRNA som ska brytas ner - Tidsbegränsad effekt ”knock-down”
Hur bryter man ner dubbelsträngad RNA?
Dubbelsträngat RNA (dsRNA) binder till proteinet Dicer som klyver dsRNA i mindre bitar.
Ett annat proteinkomplex, RISC plockar upp den ena RNA-strängen.
RISC med sitt RNA binder till mRNA. mRNA bryts ned. Inget protein bildas.
CRISPR/Cas9
Vi kan permanent påverka genuttrycket med hjälp av CRISPR/Cas9-teknologin medan för siRNA är tillfälligt
- Bakteriellt skydd mot bakteriofager (virus) som utnyttjas
- gRNA= guide-RNA komplementär till ”mål-DNA”
- Cas9 = bakteriellt endonukleas som klyver DNA.
- Permanent effekt –> ”knock-out” (KO) och ”knock-in”/gene-editing (Kin)
På Cas9 tillsätter vi en gRNA som guider Cas 9 till rätt sekvens i DNA
Restriktionsenzym och Ligas
Restriktionsenzym: Känner specifika sekvenser av DNA och klipper av dem
Ligas: limmar ihop två DNA strängar
Rekombinant DNA teknologi
Rekombinant DNA teknologi: Genom den kan man antingen:
Genmodifiera celler: Föra in gener i celler för att producera protein.
Först och främst använder vi oss av bakterier (Prokaryoter).Det vi använder oss mest av är bakterier för att de delar på sig snabbt och billigt.
Beroende på protein, dess funktion kan man använda sig av eukaryota mikroorganism (Jästceller). Om man vill ha en bättre veckning på protein använder man jästceller
Däggdjurceller / mammalieceller: För glykosylering
Protein som vi vill producera som kan används som LM, saknas hos individer.
Ersättnings terapi t.ex insulin
Genmodifera djur: Kan ske med olika metoder:
Mikroinjektion: Man injicerar i ett befruktat äggcell
ES-celler
Kloning / Somatisk cellkärna överföring
Pharming: Att man använder djur för att producera LM.
Låta bakterier producera proteiner
Med hjälp av att låta bakterier producera proteiner kan vi producera LM, t.ex insulin:
Bakteriepopulationen fördubblas var 30:e minut –> miljontals nya bakterier efter 24 timmar
Plasmid sätts in i DNA, man transformera bakteriecellen.
Tillväxt i antibiotika kultur, för att ta bort bakterier som inte har resistent mot antibiotika, som inte har tagit upp genen kodande för proteinet.
Genmodifierade mikroorganismer kan producera rekombinant protein.
Genmodifierade mikroorganismer kan producera rekombinant protein.
- Bakterier, ofta E. Coli: Enkel, billigt och snabbt, stora mängder. Kan användas inom:
- Grundforskning: Man vill produceras proteinet för att studera dess funktion
- Produktion av proteiner på industriell skala, t.ex:
- Tillväxthormon
- Insulin
- Svamp, ex. Aspergillus Niger. Är för att man vill producera ett avancerat protein
- Enzymer - ofta muterade för bättre egenskaper. Man måste alltså utveckla dem, de måste därför vara rätt veckade, så att de exempelvis binder bättre.
* Tvättmedel: Enzymer finns i tvättmedel., då de kan bryta ner i fett
* Laktosfri mjölk: Används för att bildas laktosfri mjölk, där man tillsätter laktas till mjölken för att bryta ner laktos.
Produktion av rekombinant protein i bakterier
Produktion av rekombinant protein i bakterier
Ett humant protein som ska tillverkas
Genen som kodar för proteinet sätts i vektor (Plasmiden)
Bakterien tar upp plasmiden som innehåller gen för proteinet
Med hjälp av den bakteriella transkriptionen och translation får vi det human genet.
Expressionsvektorns anatomi
- Ori = origin of replication. Är utgångspunkten för replikationen (Kopiering)
- Polylinker – restriktionssite: Här finns många DNA sekvenser som kan känns av restretionsenzym som kan klippa och de är för att öppna upp vektor så att vi kan sätta in det valde proteinet.
Vektor (Plasmid) är en dubbelsträngad DNA
- Selektionsmarkör - AmpR: För att kunna skilja på bakterier, för att kunna sortera, vilka har tagit resistans egenskapen.
Denna del av plasmiden innehåller alltså gener som ger resistent mot AMP t.ex.
- Promotor: Behövs för att starta transkriptionen
- Bindningsställe för ribosom: Var ribsomen ska binda för att ribosomen ska kunna omvandlas från mRNA till protein.
- Transkriptions- termineringssekvens: Var transkription ska stanna. Utan den skulle vi haft allt med även de sekvenser som ej behövs.
Punkt 3 till 6 = Specifika för värdcellen! Alltså för en jästcell, då är något annat.
Det viktigaste är promotor, utan den ingen transkription och inget protein
Promotorn
Promotorn är viktig för att produktion av proteinet ska ske:
- Promotorn måste passa värdcellen
- E coli –> E. coli-promotor behövs - Stark promotor, att den oftast startar transkription vid denna punkt –> transkriptionen sker oftare –> mer produkt
- Möjlighet att kontrollera uttrycket (får inte gå för snabbt), vi vill inte att mRNA produktion ska gå snabbt, produkten som bildas kan vara toxiskt, därför måste den kunna kontrolleras
Laktospromotorn är populärast, för att den uppfyller alla krav
Produktion av insulin - Förr och nu
Produktion av Insulin
Förr: insulin renades fram från bukspottkörtel från ko och gris, det var möjligt för att
- Liknar mänskligt, men…
- Svårt att rena fram, kan få med andra protein än insulin
- Risk för allergiska reaktioner, alltså leder till immunsvar mot insulinet men även de proteiner som ej kan renas fram.
Nu: produktion av rekombinant insulin i bakterier, Lättare att isolera, används för att:
- Insulin behöver inga post-translationella modifieringar, inga glykosylering, fler glukos som sätts på protein
- Relativt litet och enkelt protein
Insulin består av:
* A-kedja: 21 aminosyror
* B-kedja: 30 aminosyror
Sitter ihop med disulfid bindning
Post trasnktionell modifering av inulin efter produktion av insulin med bakterier
Post trasnktionell modifering av inulin efter produktion av insulin med bakterier:
Efter translationen av insulin via bakterien, har vi A och B kedjorna, men även C kedjan.
Hos människa klippas C bort för att få aktivt insulin. Men bakterien kan inte göra det.
Efter translationen av insulin via bakterien, måste vi Att ta in DNA och kodar för A och B, för att bli av med C. Man gör det via:
Genen som kodar av A blir som en plasmid och hamnar i en kärl
Genen som kodar för B hamnar i en annan kärl
De växer till för att isolera A och B för sig.
Därefter blandas dem ihop tillsammans med ett oxiderande ämne för att endast få A och B kedjorna.
Nackdelar med bakerier som producerar
Det går inte alltid bra att använda bakterier för produktion av humant protein
- Den humana genen innehåller bakteriella transkriptionstermineringssekvenser
Eukaryota och prokaryota celler har olika transkriptionstermineringssekvenser, vilket gör att eukaryota gener kan innehålla bakteriella transkriptionstermineringssekvenser, som säger åt bakterien att stoppa transkription, utan att det bör stoppas där.
Bakterier har olika transkriptionstermineringssekvenser än oss, detta leder att det avbrytas mitt i genen. mRNA blir för kort, samt att proteinet blir kort.
- Den humana genen innehåller introner. Bakterier har inte splicing av pre-mRNA, de skulle transkribera exoner men även introner.
- Vissa proteiner kräver post translationella modifieringar krävs för funktionellt protein
- Glykosylering
- Fosforylering
Glykosylering och Fosforylering finns inte i bakterier, då får man därför ingen effekt.
- Komplicerad proteinveckning krävs för funktionellt protein
Potentiella lösningar för bakerier produktion
Potentiella lösningar:
Transkriptionstermineringssekvenser i humana genen
- Introducera tysta mutationer, då tysta mutationer har ingen effekt.
- Tillverka ny sekvens (om <1kb i storlek). Göra nytt verkande DNA.
Genen innehåller introner
- Använd mRNA som mall och gör cDNA, då använder man omvänd transkription
Moget mRNA innehåller bara exoner cDNA blir därför intron-fritt.
Kemiska modifieringar och veckning svårare
- Använd annan celltyp, det går inte längre med bakterier, istället använder man eukaryota celler, och då behöver vi en annat expressionsvektorns
Alternativ istället för bakterier
Alternativ 2:
Eukaryota mikroorganismer
- Jästsvamp, Saccharomyces cerevisiae.
* Fördel: Bra veckning
* Nackdel: överglykosylering, om proteinet behöver ha korrekt glykosylering.
Alternativ 3:
Däggdjursceller:
- Man använder cancerceller, för att de kan dela på sig hela tiden (Odödliga) eller immortaliserade celler
- Nackdelar:
* Mindre produktion: Däggdjur delar sig mindre än bakterier
* Svårt med selektion: De som har tagit farm våra expresiosnvektor. Med bakterier, med antibiotika
* Risk för infektioner –> Kräver många kvalitetskontroller.
Produktion av faktor VIII (Däggdjurceller)
Exempel: produktion av faktor VIII (Däggdjurceller)
Blödarsjuka:
- Genetisk sjukdom, ärftlig brist på koagulationsfaktor VIII
- Recessiv sjukdom, innebär att det behövs två alleler för att sjukdomen ska utvecklas - mutation på X-kromosomen –> mest män drabbas
För att män är XY
Kvinnor XX (Mindre sannolikhet att båda X är mutation)
- Symptom: blåmärken, näsblod, blödningskomplikationer
- Behandling: injektioner med faktor VIII, ersättningsterapi
Då: Renades fram från donerat blod
- Men kan orsakar risk för blodsmitta: Hepatit och HIV
Nu testas all donerat blod, men så visste man inte om det. Många patienter fick infektionen via behandlingen.
Rekombinant framställning svår, det krävs post transaktionella modifiering och glykosylering, därför använder vi oss av däggdjur.
Nu: Hamsterceller (CHO-celler)
Det finns flera sätt att genmodifiera djur
Det finns flera sätt att genmodifiera djur
- Genom mikroinjektion av befruktade äggceller
- Genom användning av embryonala stamceller
- Genom kloning (somatisk cellkärneöverföring)
Mikroinjektion för framställning av transgena djur
- Konstgjord befruktning: En äggcell befruktas med en spermie.
- Innan sammansmältning av kärnorna (Ägg och spermie), tunn glasnål sprutar in rekombinant DNA - Befruktat ägg till fostermödrar
- Ungar föds
- Testa om genen integrerats rätt
- 10-40% av fallen hamnar det på rättställe
Nackdelar:
- Brutal teknik för ägget
- Går åt mycket djur
- Slumpvis integrering
* tyst, då sker inget uttryck
* enhancer eller promotor från annan gen
ES-celler
ES- isoleras från embryo (Blastocyter), tas ut och odlas i skål. Kan dela sig för bilda olika celltyper.
ES-celler och framställning av transgena djur
ES-celler kan användas för framställning av transgena djur (Vanligaste metoden)
- För in önskad gen i ES-cell
t.ex. mikroinjektion eller vektor - Testa om genen fungerar som önskat, se till att den inte hamnar tyst eller bakom en promotor eller enhancer
- För in rätt celler i tidigt embryo (Blastocyter)
- Sätt in i fostermamma
- Efter födsel: Könsceller modifierade? De som har modifierade könsceller kan paras med vanlig mus. En allel som är vanlig och annan som är modifierad. Tillslut har vi bara den egenskapen vi vill ha:
EC-celler (Nackdelar och fördelar)
Fördelar:
- Möjligt att kontrollera genfunktion och –lokalisation, innan man gör ett helt djur.
- Minskad mängd djur behövs (jmf. mikroinjektion och kloning).
Nackdelar:
- Avlingen tar tid.
- Artbegränsad metod, bara på möss.
Kloning - Process
Kloning (somatisk cellkärneöverföring)
1. Ta celler som kan dela sig från ett vuxit djur
2. För in ny gen
3. Testa cellerna, att vi har fått gener i rätt ställe
4. Ta ut cellkärna, Som innehåller rätt antal kromosomer
5. Sätt in i äggcell utan kärna. Ägg har bara 23.
6. El chock –> ”befruktat” –> delning –> embryo
7. Plantera in i fostermamma
8. Klonad avkomma
Kloning (Fördelar och nackdelar)
Fördel:
- Kan användas på alla djur
- Möjligt att kontrollera genfunktion och -lokalisation
Nackdelar:
- Mycket arbetskrävande
- Mycket kan gå fel:
* Misslyckad implantation
* Tidiga/sena missfall
* Missbildningar
* Dödfödda djur
Rekombinanta proteiner produceras av djur
Rekombinanta proteiner kan också produceras av djur
Transgena djur kan uttrycka rekombinanta proteiner i
- blodet
- ägg - höns
- mjölken - får, grisar, getter
Antitrombin III - Används ibland vid hjärtkirurgi, för att undvika att blodet korrigerar
- I mjölk hos getter
- Promotor som bara är aktiv i mjölkkörtlar
- 80 getter –> nog antitrombin III för hela Europa