principes; cours 2, examen final

Question 1

définir ce qu’est le SDS

Answer 1

détergent anionique dont le groupement sulfate possède une charge négative;

Question 2

nommer les 2 fonctions du SDS

Answer 2

peut d’une part: s’associer et dissoudre les molécules hydrophobes, notamment les lipides, et dissoudre les membranes cellulaires

d’autre part; le SDS peut s’associer et solubiliser les protéines,

Question 3

après le traitement au SDS, qu’auront les protéines comme caractéristiques

Answer 3

1) ne conserveront que leur structure primaire; le SDS les dénarure sans briser les liens peptidiques ni les ponts disulfures

2) auront une charge nette négative; elles vont ttes migrer vers le pôle positif en fonction de leur masse lorsqu’elles seront placées dans un champ électrique

Question 4

décrire comment se fait la dénaturation totale des protéines

Answer 4

chauffage dans un tampon contenant du SDS et un agent réducteur (mercaptoéthanol)

Question 5

quel est le rôle de l’agent réducteur lors de la dénaturation totale des protéines

Answer 5

va réduire les ponts disulfure de résidus cystéine pour libérer les groupes sulfhydrile

Question 6

sur quel critère repose la migration des protéines sur le gel

Answer 6

slmt selon leur poids moléculaire;

les effets de la conformation et sa charge intrinsèque s’annulent, n’influencant pas la migration

Question 7

définir le gel de polyacrylamide et ses composants

Answer 7

support gélatineux finement réticulé, fabriqué en mélangeant:

-acrylamide
-bis-acrylamide

réseau avec des mailles variables; se comporte comme un tamis moléculaire

Question 8

à quoi sert l’acrylamide dans le gel de polyacrylamide

Answer 8

il polymérise en donnant des chaines linéaires

Question 9

à quoi sert le bis-acrylamide dans le gel de polyacrylamide

Answer 9

va former des chaines ramifiées

Question 10

un gel discontinu en concentration de polyacrylamide est utilisé en 2 parties;

nommer les en ordre ainsi que leurs caarctéristiques

Answer 10

EN HAUT: gel de compression à 5% en acrylamide à pH 6.8

EN BAS: gel de résolution de 5-20% en acrylamide à pH 8.8

Question 11

quel élément de chacun des gels va leur conférer leur pH différent

Answer 11

le tris-HCl

Question 12

décrire la composition du gel de compression 5%

Answer 12

-eau déionisée

-acrylamide mix 30%

-tris-HCl 1,0M pH 6.8

-SDS 10%

-APS 10%

-TEMED 100%

Question 13

décrire la composition du gel de résolution 12,5%

Answer 13

-eau déionisée

-acrylamide mix 30%

-tris-HCl 1,5M pH 8.8

-SDS 10%

-APS 10%

-TEMED 100%

Question 14

décrire les composants du tampon de migration à pH 8.3

Answer 14

-Tris base 25mM (NaOH)

-glycine

-SDS

-compléter avec H2O

Question 15

décrire les étapes du principe du gel de compression

Answer 15

1) les ions Cl- prennent de l’avance, laissant un vide ionique dans lequel les protéines n’avancent pas

2) les ions glycine avancent un peu, et leur front de migration portent les protéines; la glycine devient leur seul électrolyte dispo, ce qui concentre els protéines en une bande

3) à l’interface des 2 gels, les ions glycine deviennent plus mobiles et le front d’ion dépasse la bande de protéines

4) les protéines ont mtn assez d’électrolyets de part et d’autre, et vont se séparer et migrer dans le gel de résolution selon leur poids moléculaire

Question 16

quel gel de résolution permet de bien séparer la GFP de la GAPDH

Answer 16

gel 12.5% d’acrylamide

Question 17

comment choisit-on un gel de résolution pour une expérience

Answer 17

en fonction de la taille des protéines à séparer

Question 18

que permet la technique de western blot

Answer 18

permet de déterminer, de facon spécifique, le niveau d’expression d’une ou plusieurs protéines

Question 19

quelle est la première étape nécessaire pour effectuer un western

Answer 19

il faut absolument débuter par une migration des protéines sur SDS-PAGE

Question 20

après la migration et séparation des protéines une fois l’électrophorèse terminée, que faut-il faire pour mieux détecter les protéines d’intérêt

Answer 20

il faut procéder à un transfert sur une matrice

Question 21

à quoi servent les matrices (membranes de nitrocellulose)

Answer 21

elles vont lier les protéines de facon hydrophobe et électrostatique

Question 22

par quel principe les protéines transfèrent sur la membrane

Answer 22

après empilement de membranes et papiers filtres entourant le gel;

les protéines sont tjrs entourées de SDS, donc sous l’influence d’un champ électrique, les protéines chargées négativement vont migrer de l’anode vers la cathode

Question 23

pour quelle raison fait-on un blocage après le transfert des protéines sur une membrane

Answer 23

on bloque tous les sites de fixation potentiels de l’anticorps utilisé pour la détection immunologique;

on veut assurer la spécificité de la technique

Question 24

qu’arriverait-il si l’étape de blocage ne serait pas effectuée

Answer 24

l’analyse par image décèlerait une détection des bandes supplémentaires non spécifiques

Question 25

comment se produisent les signaux observables par utilisation des anticorps

Answer 25

les anticorps sont liés, par leur région Fc, à un enzyme rapporteur, comme la phosphatase alcaline (AP) ou la peroxydase de raifort (HRP) ces enzymes rapporteurs produisent des signaux par rxn avec des substrats pour provoquer des changements d'émission d'une lumière

Question 26

comment peut-on quantifier les changements d'émission d'une couleur

Answer 26

par densitométrie; technique utilisée pour mesurer la densité d'un groupe de protéines en utilisant un logiciel d'analyse d'image pour calculer la densité de chaque bande

Question 27

après avoir calculé les intensités des bandes par logiciel, comment peut-on les quantifier directement

Answer 27

à l'aide de marqueurs de référence ou d'un échantillon contrôle on va les comparer

Question 28

pk l'analyse de l'ARNm peut être tout aussi importante que l'analyse de l'ADN *lorsqu'une protéine est anormale ou en quantité insuffisante

Answer 28

pcq bien que la séquence codante d'un gène puisse être normale, son expression (transcription, maturation de l'ARNm, traduction) peut être déficiente **analyse d'ADN ne montrerait aucune anomalie, alors que ARNm si

Question 29

nommer les 2 méthodes de purification de l'ARN total

Answer 29

par précipitation sur colonne

Question 30

si on veut isoler et analyser slmt l'ARNm, cmt procéde-t-on

Answer 30

il faut isoler ARNm des autres types d'ARN; la purification impliquera alors une colonne d'affinité spécifique à l'ARNm

Question 31

nommer les diverses espèces d'ARN présentes dans ARN total

Answer 31

ARNm ARNr ARNt ARNsn (petits ARN nucléaires) ARNsno (petits ARN nucléolaires)

Question 32

quels principes basent les méthodes d'analyse de l'ARN

Answer 32

-principe de dénaturation réversible des structures secondaires de l'ARN -possibilité d'hybridation avec des molécules de séquence complémentaire soit en ADN ou ARN

Question 33

que fait-on pour hybrider des complexes ADN/ADN, ADN/ARN ou ARN/ARN

Answer 33

des cycles de dénaturation et de renaturation en température ou en pH

Question 34

pk l'isothiocyanate de guanidine (trizol) est utilisé lors d'extraction d'ARN total

Answer 34

il a un fort pouvoir dénaturant qui provoque la lyse des cellules et inhibe en mm temps les RNases libérées

Question 35

lors d'extraction d'ARN total, comment sont lysées les cellules

Answer 35

grâce à une solution monophasique d'isothiocyanate de guanidine (trizol) et de phénol

Question 36

l'ARN, après la lyse de la cellule, est extrait à l'aide du chloroforme que cela entraine-t-il

Answer 36

la séparation du mélange en 2 phases après centrifugation

Question 37

dans quelle phase demeure l'ARN

Answer 37

la phase aqueuse, qui est la phase supérieure

Question 38

que contiennent les phases inférieures à la phase aqueuse-ARN

Answer 38

phase intermédiaire: ADN phase inférieure-organique: ADN génomique et protéines, avec le phénol et chloroforme les deux sont rouges**

Question 39

après qu'on récupère la phase aqueuse, cmt est manipulé l'ARN

Answer 39

ARN est précipité avec un alcool (isopropanolol) froid (va former un culot au fond du microtube) lavé, solubilisé dans l'eau et dosé

Question 40

décrire les étapes de l'extraction d'ARN total sur colonne

Answer 40

-homogéiniser les cellules avec trizol -déposer sur colonne -centrifuger -laver (par centrifugation) -traiter l'ARN au DNase -laver -éluer -doser

Question 41

quel type d'ARN est le plus nombreux

Answer 41

les ARNr; sont plus de 3/4 des ARN d'une cellule

Question 42

quel type d'ARN est le moins commun

Answer 42

ARNm; slmt 1 à 5% des ARN d'une cellule

Question 43

pk les ARNm peuvent être aisément purifiés par chromatographie d'affinité, au contraire des autres types

Answer 43

pcq ce sont les seuls à posséder une queue poly A

Question 44

qcqi va retenir les ARNm sur la matrice utilisée

Answer 44

la matrice sera composée d'une chaine de thymines (oligodT), qui va retenir les queues polyA, et donc les ARNm **grâce à leur complimentarité de séquence A-T

Question 45

pk avant l'hybdridation avec les oligodt, on lave avec du NaCl

Answer 45

pour enlever les restes de ARNr et ARNt

Question 46

quelle est l'utilité de la technique PCR

Answer 46

produire une grande quantité d'un fragment d'ADN précis à partir d'une quantité minime d'un échantillon, contenant l'ADN d'intérêt

Question 47

pour quelles fins est utilisée la PCR

Answer 47

pour le clonage moléculaire la mutagenèse dirigée le marquage de sondes analyse de la chromatine (immunoprécipitation de la chromatine) détecter des agents infectieux établir des empreintes génétiques diagnostiquer des maladies génétiques analyser des variations de séquences

Question 48

nommer les 3 principales étapes de l'amplification d'ADN par PCR

Answer 48

1) dénaturation de l'ADN 2) hybridation des amorces à l'ADN matrice 3) Polymérisation de l'ADN les 3 forment un cycle PCR

Question 49

quel est le but de la dénaturation (première étape de PCR)

Answer 49

elle vise à séparer les 2 brins d'ADN, afin de permettre l'hybridation subséquente des amorces sur l'ADN simple brin

Question 50

comment se fait dénaturé l'ADN dans un cycle PCR

Answer 50

le mélange d'ADN est chauffé à 95 deg; les liaisons H entre les bases azotées des deux brins d'ADN sont brisés à une telle température, et l'ADN se retrouve en forme simple brin

Question 51

en pratique, cmb de temps prend la dénaturation dans une rxn de PCR standard

Answer 51

1 minute

Question 52

comment l'hybridation des amorces se fait lors d'un cycle PCR

Answer 52

après la dénaturation, la température s'abaisse assez pour permettre la renaturation de l'ADN; des amorces, complémentaires aux extrémités de l'ADN à amplifier, sont présentes dans le mélange réactionnel **concentration assez élevée par rapport à l'ADN matrice pour s'assurer et favoriser l'hybridation donc; hybridation entre un fragment d'ADN matrice et une amorce complémentaire

Question 53

pk très peu de molécules d'ADN double brin seront reformées à l'étape d'hybridation lors de PCR, si la température permet la renaturation

Answer 53

pcq les amorces sont placées en excès et en ratio bcp plus élevé que la concentration d'ADN à amplifié, de sorte que l'hybridation entre les 2 est favorisée

Question 54

cmt de temps l'étape d'hybridation des amorces prend dans un cycle PCR

Answer 54

1 minute; permet à l'ensemble du mélange réactionnel d'atteindre la température souhaitée

Question 55

comment la polymérisation se fait lors d'un cycle PCR

Answer 55

après l'hybridation, la température remonte à 72 degrés, afin de permettre l'élongation des amorces appariées à l'ADN matrice, grâce à la Taq polymérase (synthétise l'ADN)

Question 56

quelle est la température optimale de la Taq polymérase

Answer 56

72 degrés;

Question 57

d'où provient la taq polymérase

Answer 57

isolée à partir de thermus aquaticus

Question 58

quel est l'avantage majeur de la Taq polymérase

Answer 58

elle peut être ajoutée au début de l'expérience, et conserve une partie de son activité jusqu'à la fin puisque n'est pas inactivée à 95 degrés

Question 59

cmt de temps l'étape de polymérisation prend dans un cycle PCR

Answer 59

le temps de cette étape dépend de la longueur du fragment d'ADN à amplifier vitesse de la taq= au moins 1 kilobase par minute

Question 60

décrire la recette du mélange réactionnel PCR

Answer 60

-matrice en ADN -amorces -mix de dNTP -polymérase (taq) -ions mg2+ (cofacteurs)

Question 61

quel est le principe de la technique RT-PCR; reverse transcriptase

Answer 61

utiliser les ARNm comme matrice d'amplification de la PCR; puisque ADNc normalement utilisé est en fait une copie d'ARNm obtenu par une transcription inverse effectuée par RT

Question 62

qcq RT

Answer 62

ADN polymérase dépendante de l'ARN; elle utilise une matrice d'ARN pour former de l'ADN

Question 63

de quoi dépend le travail de RT

Answer 63

comme les autres ADN polymérases, elle a besoin des amorces et des matrices

Question 64

à quelles fins est utilisée la RT-PCR

Answer 64

-identifier des virus à ARN -mesurer le niveau d'expression d'un transcrit très faiblement représenté dans un pop hétérogène d'ARNm -construction des banques d'ADNc en vue de clonage moléculaire ou pour quantifier les ARNm qqpart

Question 65

nomm er les étapes d'analyse d'expression génique par RT-PCR

Answer 65

1) amplification par RT-PCR de l'ADN d'un gène de référence 2) séparation des amplicons par électrophorèse sur gel d'agarose, avec des marqueurs de l'ADN (agents intercalants) 3) détection par visualisation de bandes sur des gels sous UV 4) analyse de l'intensité de bandes détectées par densitométrie avec des logiciels d'analyse d'images 5) analyse graphique par ordinateur

Question 66

pourquoi fait-on une amplification par RT-PCR de l'ADN d'un gène de référence

Answer 66

pour controler les variations expérimentales de la quantité d'ARN utilisée dans chaque RT; on utilise ces gènes nommés -domestiques- pour la normalisation des données (B-actine, GAPDH)