CHAP 3; digestion enzymatique d'ADN digéré Flashcards
définir l’objectif de ce chapitre
procéder à une double digestion enzymatique de la construction pBS/GFP autant que du vecteur pUC19
quel type d’enzyme est utilisé afin de procéder à la double digestion
pour quel but
les enzymes de restriction; elles découpent l’ADN aux sites de restriction
vont permettre le sous-clonage unidirectionnel afin que l’insertion du gfp soit orienté de facon à respecter le sens de transcription du gène, à partir du promoteur lacZ dans le vecteur pUC19
quels sites seront ciblés par l’enzyme de restriction
Pst1 juste avant EcoR1
Sal1 juste après EcoR1
pourquoi entoure-t-on EcoR1
pcq des sites EcoR1 sont présents à chaque extrémité de la séquence du gène gfp
que faut-il respecter afin de procéder à l’insertion du gène gfp de facon unidirectionnelle
il faut digérer le vecteur pUC19 et la construction pBS-GFP avec les 2 mm enzymes;
ceci fera respecter le sens de la transcription du gène
quelle est la taille du gène gfp
770 pb
qcq le gène à ampicilline sur le vecteur
est nécessaire comme marqueur de sélection; savoir quelles bactéries ont incorporées le plasmide
qcq l’origine de réplication sur le vecteur
séquence d’ADN spécifique qui permet au plasmide de se répliquer de façon autonome à l’intérieur d’une cellule hôte
un vecteur doit avoir une ori compatible avec l’hôte utilisé
définir le SCM
séquence d’ADN ajouté au vecteur et va contenir les sites reconnus par les enzymes de restriciton, afin de faciliter l’introduction dirigée de fragments exogènes
où se trouve la séquence du peptide a
dans le gène lacZ, qui est le marqueur de criblage du vecteur
quelle est la conséquence de l’insertion d’un gène dans le SCM
ceci va interrompre la traduction du peptide a, en y introduisant un codon d’arrêt de traduction
fera une colonie blanche
cmb de pb va faire la construction de pBS+ GFP
si pBS fait 2961 pb
ce sera 3731 pb;
puisque GFP fait 770 pb;
770+ 2961= 3731 pb
nommer les 3 formes topologiques de l’ADN retrouvés sur le gel d’agarose
ADN superenroulé
ADN relâché
ADN linéaire
classer les formes topologiques de l’ADN selon leur vitesse de migration
ADN superenroulé migre plus rapidement que l’ADN linéaire
ADN linéaire migre plus rapidement que l’ADN relâché
quelle forme topologique de l’ADN est tt à fait artificiel
l’ADN linéaire; elle est crée quand on décide de digérer un fragment
quelle formes topologiques de l’ADN existent de facon naturelle dans nos plasmides
les formes superenroulé et relâchées;
-c’est surtt du superenroulé qui sort lors de l’extraction
si c’est surtt du superenroulé qui sort de l’extraction, cmt est faite l’ADN relâchée
à cause des manips, il y aura des débris sur l’ADN superenroulé, ce qui va finir par le relâcher (donc provient des dommages physiques)
pk après ligation de pUC19, pourrait-on quand mm retrouvé des colonies bleurs
il se pourrait que les bandes 2686pb se mélangent aux bandes 2676, si l’enzyme n’a pas fonctionné;
après purification, on pourrait avoir de l’ADN linéarisé, et donc retrouver des colonies bleues
comment l’ADN est visualisé sur le gel avec un agent intercalant
ADN double brin est détecté par l’intercalation du colorant fluorescent bromure d’éthidium entre ses bases
une fois intercalé, le colorant devient fluorescent sous UV
comment l’ADN est visualisé sur le gel avec le SYBR safe
*moins mutagène, se lie à l’ADN sans changer la structure;
est présent dans la composition du gel
comment est déterminé la taille d’une molécule d’ADN linéaire
à l’aide d’un marqueur d’ADN linéarisé, tel que 1 Kb+ DNA ladder
comment est déterminé la taille d’une molécule d’ADN circulaire
à l’aide d’un marqueur d’ADN circulaire, tel que supercoiled DNA ladder
