CHAP 8; solidification et purification Flashcards
quelle est la méthode privilégiée pour l’analyse d’expression de l’ARN d’un gène d’intérêt
la RT-PCR
nommer les 4 étapes, à partir de la récolte de cellules cultivées, pour effectuer la RT-PCR
1) isoler, purifier, doser l’ARN total à partir des cellules humaines en culture
2) analyser l’intégrité des ARN, par électrophorèse sur gel d’agarose
3) procéder à la rétrotranscription de ces ARN, pour obtenir la banque d’ADNc correspondante
4) Analyse de la quantité d’ARNm de la GAPDH amplifié par PCR, de la contamination possible des échantillons d’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose
quel est l’objectif de ce chapitre
isoler, purifier et doser l’ARN total à partir de cellules humaines en culture en comparant 2 techniques d’isolation;
précipitation et sur colonne
nommer les 3 types d’ARN assurant les fonctions au sein de la synthèse des protéines et inclut dans l’ARN total
ARNt
ARNm
ARNr
définir le rôle de l’ARNm dans la synthèse des protéines
ARNm porte l’information génétique de l’ADN copié, sous la forme d’une série de code de 3 bases, chacun spécifiant un aa
définir le rôle de l’ARNt dans la synthèse des protéines
clé de décryptage des mots encodés dans l’ARNm
chaque aa a son type d’ARNt, qui le lie et le porte au nout de la chaine poplypeptidique en synthèse
définir le rôle de l’ARNr dans la synthèse des protéines
il s’associe à un ensemble de protéines pour former des ribosomes;
ces structrues catalysent l’assemblage des aa dans les chaines de protéines
*sont composées d’une grande et une petit sous-unité, chacune contenant ses propres ARNr
définir la traduction
processus par lequel tt la séquence de bases d’un ARNm est utilisée pour commander et joindre les aa dans une protéine
pour quelle raison l’ARN est plus difficile à étudier que l’ADN
pcq il est plus vulnérable des RNase A et de la chaleur;
le travail sur les ARN doit être effectué le plus stérilement possible à cause de ces RNases environnantes
pour quelle raison milles précautions sont prises pour se protéger contre RNase lors de manipulation d’ARN
pcq cette enzyme est ubiquitaire (a les doigts couverts); elle est extrêmement active et résistante à tt les agressions normalement néfastes aux enzymes
nommer les 4 caractéristiques communes de tt les protocoles pour isoler l’ARN
1) lyse de la membrane cellulaire
2) inhibition de l’activité des RNases
3) déprotéinisation
4) isolement des ARN intacts
quelles sont les 2 raisons de l’étape d’homogéinisation des cellules comme première étape d’extraction d’ARN total
1) inhiber les RNases endogènes
2) dénaturer les acides nucléiques et dissocier les protéines qui pourraient y être fixées
nommer les composantes du tampon utilisé pour l’extraction de l’ARN
avec fonction
1) détergeant puissant SDS;
2) agent dissociant; chlorure de guanidine
3) solution tampon; acétate
4) agent réducteur à haute concentration; 2-mercaptoéthanol
définir ce qu’est le TRIzol et sa fonction au sein de l’extraction d’ARN
le TRIzol est un réactif concu pour isoler l’ARN total de haute qualité dans un échantillon de cellules
ses composantes facilitent l’isolement de diverses espèces d’ARN, tout en maintenant leur intégrité
comment ecq le réactif TRIzol peut isoler sans toucher à l’intégrité de l’ARN
il effectue une inhibition très efficace de l’activité RNase tout en procédant à la rupture de cellules et la dissolution de composants cellulaires pendant l’homogéinisation
qu’arrive-t-il lorsqu’on ajoute du chloroforme après homogéinisation de l’échantillon avec TRIzol
l’homogénat se sépare en une couche supérieure claire et aqueuse—ARN
interphase et couche inférieure organique rouge— ADN et les protéines
comment l’ARN est extrait de la phase aqueuse
par précipitation avec l’isopropanol
pourquoi ne faut-il surtout pas toucher aux parois quand on va chercher la phase aqueuse
pcq elles peuvent contenir des traces de RNases
quelle méthode d’isolation est meilleure pour le rendement
la précipitation; on va obtenir plus de quantité
quelle méthode d’isolation est meilleure pour la contamination
la colonne; elle aura peu ou pas de contamination d’ADNgénomique
ARN sera de plus haute qualité
décrire la procédure de colonne avec le kit
il suffit d’appliquer un échantillon homogéinisé dans le TRIzol à la colonne
il reste ainsi à centrifuger, laver et faire l’élution de l’ARN
quelle est la différence majeure entre le protocole de précipitation et celui de colonne
la méthode sur colonne ne nécessite pas de séparation de ohase, de précipitations ou de post-étapes de purification, comme la précipitation l’exige
Dans la méthode d’isolation de l’ARN sur colonne, pourquoi fait-on un traitement avec de la DNAse I alors que dans la méthode d’isolation par précipitation, on ne le fait pas?
elle n’est pas nécessaire lors de la précipitation, car la séparation des phases fait déjà en sorte que l’ADN et l’ARN sont séparés
lors de méthode sur colonne, on a besoin d’un traitement à la DNase1 afin de séparer ADN et ARN, puisqu’ils sont tous les 2 capables de se lier à la colonne
pk le TRIzol est manipulé sous la hotte avec des gants
pcq il est très volatile; la hotte permet de contenir les fumées irritantes
produit toxique et potentiellement mutagène si on ne porte pas de gants
ecq le réactif de trizol est utilisé pour la mm raison dans le protocole de précipitation que celui sur colonne
oui; va être utilisé pour lyser les cellules, dénaturer les protéines, tout en protégeant l’intégrité de l’ARN par son activité inhibitoire RNase
pourquoi lors du protocole de précipitation, l’isopropanol est à 99%, alors que l’éthanol est à 75%
l’isopropanolol est utilisé pour faire précipiter l’ARN; plus elle est concentrée (99%), plus facile sera la précipitation
l’éthanol est utilisé pour laver l’échantillon afin d’éliminer les sels et autres contaminants; sa force de 75% permet à son eau (25%) de dissoudre les impuretés hydrosolubles, tout en gardant l’ARN précipité
à quoi sert l’eau DEPC
L’eau DEPC est utilisée pour préparer des solutions exemptes de RNases;
le DEPC modifie les résidus histidine dans les protéines, inactivant les RNases de manière irréversible
ainsi, évite la dégradation de l’ARN qu’on veut extraire**inhibiteur de RNase
nommer les éléments du kit de purification d’ARN présent dans le protocole sur colonne
-tampon de prélavage d’ARN
-tampon de lavage d’ARN
-eau DEPC
-colonnes RB (RNA binding)
-tubes collecteurs
nommer les composantes des 3 phases lors de précipitation
phase aqueuse: ARN
interphase: ADN
phase inférieure: organique, rouge, protéines et lipides
comment va-t-on comparer les deux méthodes sur la qualité de leur ARN
par dosage spectophotométrique;
260-280: attendu 1.8 et 2.1
260-230: attendu entre 2 et 2.2
