CHAP 7; western blot Flashcards
définir le principe de ce chapitre
mesurer et vérifier l’expression et la production de protéine recombinante gfp induite dans des bactéries transfo avec le produit de sous-clonage
comment l’induction et expression de gfp est-il vérifié
puisque les bactéries utilisées ne produisent pas de gfp endogène, si l’on détecte sa production après transfo avec le produit de ligation et production protéique;
il y a réussite du sous-clonage du gène gfp dans pUC19
nommer les principales étapes du western
1) migration des échantillons protéiques via SDS-PAGE
2) transfert des protéines du gel d’acrylamide vers une membrane de nitrocellulose
3) blocage et hybridation des anticorps et détection des protéines recherchées
quelle autre protéine sera mesurée en plus de gfp
GAPDH; protéine de normalisation
afin de faire une évaluation semi-quantitative, puis de comparer avec gfp
la méthode d’électrophorèse utilisée est le SDS-PAGE
que fait SDS
dénaturant ionique; chargé négativement, il se lie aux protéines et leur confère une charge négative homogène
lyse des membranes, surtt lorsque les échantillons sont bouillis
va aussi dénaturer les protéines, ce qui les linéarisent
à quoi sert le mercaptoéhanol utilisé
il réduit les ponts disulfures de résidus cystéine des protéines pour libérer des groupes sulfhydryle
que fait le chauffage dans du SDS-mercaptoéthanol
il perturbe les intercations intramoléculaires et entre les protéines;
va donner des polypeptides individuels, qui portent un excès de charge négative, induite par SDS
le persulfate d’ammonium agit avec TEMED;
que font-ils
ce sont des catalyseurs;
vont favroiser la formation de radicaux et ils catalysent la polymérisation du polyacrylamide (gel)
les protéines de 10-20 kDa sont séparées à quel % d’acrylamide
à plus de 15% d’acrylamide
les grosses protéines sont séparées à quel % d’acrylamide
mieux séparées à 5-10% d’acrylamide
on utilise un gel discontinu
nommer ses 2 parties et leur %
gel du haut; gel de compression à 5%
gel du bas; gel de résolution à 12,5%
pk le gel de compression a tjrs une concentration d’acrylamide plus basse que le gel de résolution
afin de faire circuler les grosses protéines
quel est le pH du gel de compression
6.8
quel est le pH du gel de résolution
8.8
décrire les pores et force ionique du gel de compression
de plus gros pores (est fait pour les grosses protéines)
force ionique plus faible
décrire les pores et force ionique du gel de résolution
pores plus petits, plus grande force ionique
quel est le pH du tampon de migration
8.3
nommer les composants du tampon de migration
tris base NaOH
glycine
SDS
compléter avec de l’eau
que fait la glycine au sein du tampon de migration
va changer de charge en fonction du pH qu’elle traverse (à travers les 2 gels);
plus elle s’approche du 8.8 (gel de résolution), plus elle va prendre le dessus par rapport aux protéines
nommer les composantes des deux gels
eau déionisée
acrylamide mix 30%
tris HCl
SDS
APS
TEMED
pk le gel est nécessairement composé d’acrylamide ET de bis-acrylamide
pcq acrylamide va faire des chaines linéaires
tandis que
le bis va faire les ponts
le mix est nécessaire pour créer le genre de tamis moléculaire
comment on fait pour sortir les protéines du gel tout en conservant le patron de séparation en fonction de taille
en transférant sur une membrane de nitrocelluse; c’est un support immobilisant
décrire les propriétés de la membrane de nitrocellulose
c’est une matrice chargée négativement; elle lie les protéines de facon hydrophobe et électrostatique
quelle est la différence dans le placement des électrodes lors du transfert
elles sont de part et d’autre du gel, et non dans le plan du gel
comment vont migrer les protéines par rapport aux charges
de l’anode (+) vers la cathode -
nommer les 2 anticorps utilisés
anticorps primaire va se lier à la protéine GFP transférée sur la membrane
l’anticorps secondaire, lié à une phosphatase alcaline, va se lier à la portion Fc de l’anticorps primaire
comment va se produire la lumière, qui sera détecter pour quantifier les anticrorps-protéines
l’enzyme lié sur l’anticorps secondaire va réagir lors d’ajout du substrat HRP
avant de procéder à la détection immunologique, quelle étape importnte est requise
le bloquage; il faut bloquer tous les sites de fixation potentiels non utilisés de la membrane
on sature la membrane, et ainsi, spécifie encore plus la liaison anticorps-protéine
**anticorps primaire va donc compétitionner avec les protéines de lait
quelle bande apparait entre celle du GAPDH et du gfp sur la membrane
une protéine de fusion gfp peptide a;
lorsque le codon stop n’est pas reconnu dans le ribosome, ce qui explique la présence de cette protéine (elle est la slmt lorsque gfp induit)
pk va-t-on utilisé le rouge de ponceau
afin de voir le patron des bactéries;
va aussi servie à choisir une protéine isolée pour la comparer
comment a-t-on calculé le niveau relatif d’expression de la GFP pour chaque échantillon (les NI et les IND)
on calcule le ratio de densité GFP
sur le ratio de densité du contrôle de normalisation (GAPDH ou tout autre protéine choisie)
comment a-t-on calculé le niveau relatif d’induction de la GFP pour CP, 5uL et 15uL
on calcule le ratio du niveau d’expression de gfp IND sur le niveau d’expression de gfp NI
comment peut-on conclure qu’un échantillon a une induction significative de gfp
si cet échantillon résulte un ratio qui dépasse la valeur d’induction relative minimale de 1,2
**va refléter la stimulation réussie de l’IPTG sur l’expression de GFP
