CHAP 1; transfo bactérienne Flashcards
définir l’objectif général scientifique de ce chapitre
procéder à la transfo des bactéries hôtes E.coli DH5a avec les ADN plasmidiques à amplifier en vue de sous-clonage; pbluescript/GFP et vecteur pUC19
définir ce qu’est la transformation
processus de transfert génétique où l’ADN provenant d’une bactérie donatrice est englobé par la cellule réceptrice;
l’ADN est libre dans le milieu avant d’être incorporé par la bactérie réceptrice; elle va devenir -transformée-
à quoi est lié l’efficacité de la transformation
à la capacité d’une bactérie à incorporer l’ADN étranger du milieu environnant dans son milieu intracellulaire; cette capacité est désignée compétence
plus une bactérie est compétente…
plus elle est capable d’incorporer l’ADN étranger dans son milieu intracelullaire
que requiert des souches comme EcoliDH5a pour être compétente
il faut des conditions physsico-chimiques particulières mises en place pour exhiber une compétence
par quelle méthode la transformation a-t-elle lieu
par choc thermique; elle implique l’incubation bactérienne en présence de CaCl2, et de changement rapide de température
à quoi serviront les bactéries DH5aF1q
amplifier la quantité d’ADN plasmidique de départ, donc le vecteur de clonage pUC19 et la construction pBS/GFP
que va permettre d’exprimer la souche bactérienne
va permettre l’expression du gène lac1, qui encore le répresseur lac1, qui réprime le gène lacZa sur des vecteurs d’expression (pUC19 ou pBS)
il sera possible d’induire la protéine gfp placée sous le controle du promoteur lac, en présence d’IPTG
pour quelle raison le plasmide pUC19 a été choisi comme vecteur accepteur du gène gfp
1- le vecteur comporte un marqueur de sélection; les gènes de résistance aux antibios (ici, c’est AmpR)
2- permet de faire le sous-clonage unidirectionnel
quel est le marqueur de sélection du vecteur pUC19
son gène résistant à l’ampicilline; ainsi, tt les colonies vont pousser et résister à la souche comportant l’antibio
on va savoir quelles colonies ont incorporé le vecteur
comment les bactéries se différencient grâce à l’étape de criblage
le marqueur de criblage a un rôle complémentaire à celui de sélection;
les bactéries sont différenciées par une caractéristique; leur couleur
lors du criblage, que signifie les colonies bleues
le plasmide conduit à l’expression du peptide a (remplace la partie défectueuse de la mutation du gène lac),
ne porte pas l’insert gfp
lors du criblage, que signifie les colonies blanches
elles comportent l’insert; confirmer par leur fluorescence
pk lors du protocole, on fait au moins une dilution
pour pouvoir être capable à la fin de compter les colonies présentes sur la gélose
comment s’effectue le choc thermique
on va déposer dans un bain marie, puis les refroidir direct dans de la glace
quel est le rendement attendu pour une transformation à partir d’un plasmide purifié
~10⁶ à 10⁸ colonies/µg d’ADN
