CHAP 11; PCR et analyse amplicons sur gel Flashcards
définir l’objectif de ce chapitre
amplifier l’ADNc correspondant à un ARN spécifique (GAPDH) via PCR, puis analyser les amplicons sur gel
pk n’est-il pas possible de soumettre directement les ARN à la rxn de PCR, si le but est d’étudier leur expression
pcq ils seraient dégradés lorsque la température du cycle PCR monterait à 94 degrés
à quoi servent les amorces sens et anti-sens
ce sont les oligonucléotides;
vont s’hybrider de manière spécifique sur le brin, grâce à la complémentarité des bases, de facon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier
quelle est la température optimale de la Taq polymérase
72 degrés
**résistent aux passages de 95 degrés; elle est thermorésistante
dans quel sens synthétise la taq polymérase
elle sythétise le brin complémentaire d’ADN dans le sens 5-3 à partir d’un bout d’ADN double brin
quels sont les éléments de base utilisés par la taq polymérase pour synthétiser les brins d’ADN complémentaires
les 4 nucléotides;
dGTP, dATP, dTTP, dCTP;
appelés les dNTPs
une réaction PCR est la succession de cmb de cycles
une trentaine
nommer les 3 étapes de la PCR et expliquer
1) dénaturation de l’ADN par la chaleur (94 degrés); ponts H sont brisés et les 2 brins se séparent
2) hybridation des amorces avec leur séquence complémentaire (autour de 58 degrés); elles s’hybrident chacune sur son brin respectif
3) élongation ou synthèse d’ADN, dont la séquence est complémentaire à celle du brin cible (72 degrés); activation de la Taq polymérase, qui va ajouter les nucléotides dans le sens 5 vers 3 à l’ADN simple brin, pour générer une molécule double brin
les résultats du PCR dépendent des conditions et de la concentration des composants du milieu réactionnel;
nommer des exemple
-concentration de mg2+
-concentration d’ADN, d’ARN
-concentration de dNTPs ou des amorces
nommer les précautions à prendre afin d’obtenir des échantillons de qualité;
- éviter les contaminations avec l’ADN
-utiliser des microtubes, micropipettes, embouts stériles
-porter des gants
-ajouter ADN comme dernier élément du mélange
à quelles fins est utilisée la RT-PCR
-construction de banques d’ADNc
-tri d’ARNm
-construction de sondes d’ADN
-séquencer, cloner
pk fait-on la mesure de gènes dits domestiques
pour la normalisation de données d’expression de gènes cibles
GAPDH, b-actine, etc
quelle est l’une des difficultés d’amplification de l’ADN par RT-PCR
la préparation des ARN, qui peuvent être facilement dégradés et contaminés par de l’ADN génomique
comment prévoit-on la dégradation d’ARN qui peut influencer nos résultats
on fait un contrôle négatif lors de l’étape PCR;
on utilise le gène encodant pour la GAPDH afin de comparer les données d’expression génétique
quel est l’objectif derrière ce contrôle négatif de la PCR
que si lors de l’extraction de l’ARN, de l’ADN génomique a été retenu dans l’échantillon, lors de la PCR, les ARN seront dégradés et l’ADN génomique restera, sera amplifié et ainsi détecté
que veut dire la détection d’un amplicon dans la rxn PCR effectuée sur l’isolat d’ARN
cela signifie que l’ADN génomique contamine cette préparation d’ARN
présence de signal = contamination
nommer tous les éléments de la recette de l’amplification par PCR et leur fonction
-matrice en ADN; correspond à tous les ARNm
-amorces; oligonucléotides
-mix de dNTP; pour que la polymérase synthétise
-Taq polymérase
-ions mg2+ qui servent de cofacteur à la polymérase; ils vont stabiliser l’interaction de l’enzyme et activer son site catalytique
que fait le tris-hcl dans le tampon pcr 10x
il maintient un pH stable optimal pour l’activité de l’ADN polymérase
que fait KCl dans le tampon PCR 10x
il favorise l’hybridation des amorces à l’ADN matrice en stabilisant les interactions électrostatiques entre les brins d’ADN
améliore la spécificité de l’amplification et réduit les amorces non-spécifiques
quel est le but du 2 contrôle négatif
vérifier l’absence ou la présence d’ADN contaminant dans les réactifs utilisés;
eau, tampon, dNTP, amorces, enzyme
comment calcule-t-on la quantité relative d’ADN génomique dans l’ARN isolé en %
(valeur densito de RT+TN sur RT) +1 multiplié par 100
plus le % est élevé, plus l’échantillon est contaminé
