CHAP 9; analyse de l'intégrité d'ARN Flashcards
définir l’objectif de ce chapitre
analyser l’intégrité de ces ARN par électrophorèse sur gel d’agarose
les molécules d’ARN sont chargées négativement; vont se déplacer vers l’anode
qcqi va déterminer la migration de l’ARN dans le gel
c’est sa longueur; les longues molécules d’ARN se déplacent plus lentement que des fragments plus courts
pour quelle raison spécifique, relative à la migration du bout d’ARN sur le gel, on séparer et dénature l’ARN total
on le fait afin de se débarasser des structures secondaires; la dénaturation perturbe les liens H;
ARN va donc migrer sans sa structure secondaire, qui la ralentirait sinon
**ARN migre mieux en étant sous forme de molécule simple brin relativement linéaire
quel est l’agent dénaturant le plus utilisé lors de l’électrophorèse de l’ARN
formaldéhyde
**il va aussi protéger l’ARN contre l’activité hydrolytique des RNases
quelle étape supplémentaire est nécessaire, en plus des agents dénaturants, afin d’assurer la dénaturation des structures secondaires de l’ARN
le chauffage des échantillons à 65 degrés pdnt 5 minutes avant de les déposer sur le gel
va assurer que l’ARN reste sous forme linéaire; la chaleur inactive aussi les RNases et active l’effet dénaturant du formamide
définir la structure secondaire de ARNr
elle est composée de doubles brins, de tiges, de boucles
pourquoi les ARNr deviennent des marqueurs lors de l’analyse de netteté des bandes sur le gel
puisqu’ils sont de grande taille et présents en grande quantité;
s’ils sont intacts, on peut conclure que tous les ARN de l’échantillon le sont également
qu’indique la présence de trainées blanchâtres sur le gel
c’est un signe de grande dégradation des ARNr
à quoi sert le ratio d’intensité de signal des ARN 28S sur ARN18S
il va être également un indicateur de l’intégrité des ARN en général dans l’échantillon;
le rapport doit être d’une valeur égale u supérieur à 2 pour un extrait d’ARN total non-dégradé
pourquoi le ratio de 28S/18S doit être de valeur égale ou supérieure à 2 pour un ARN non dégradé
puisque l’intensité de 28S est souvent le double de celle de la bande 18S
les nt sont aussi un peu plus que le double de la taille (5070–1879)
nommer les composantes du tampon d’échantillon pour l’ARN
formamide
formaldéhyde
MOPS
eau-DEPC
nommer la fonction du formamide
désactiver les RNAses
va aussi perturber les liaisons H et empêcher la formation de structures secondaires; stabilise ARN
nommer la fonction du formaldéhyde
efficace pour désactiver RNase + dénaturer les ARNr
nommer la fonction du MOPS
préserve la transmission du courant et le pH stable lors de la migration sur gel, ce qui prévient la dégradation de l’ARN
nommer les composantes du tampon de chargement
bleu de bromophénol
glycérol
EDTA
nommer la fonction de l’EDTA
inhiber certaines RNases
qu’apercoit-on sur l’échantillon qui n’a pas recu de tampon SB
il y a une dégradation plus rapide, puisque l’ARN n’est pas protégé des RNases; caractérisé par les trainées sur cette colonne
l’ARN va aussi migrer sous forme repliée ou encombrée de structures secondaires
qu’apercoit-on sur l’échantillon qui a recu du tampon SB, mais qui n’a pas été chauffé
l’échantillon n’est pas assez dénaturé;
on apercoit des bandes plus petites que 18S et 28S sur la colonne, qui pourraient correspondre à des structrures secondaires,
la migration n’est plus linéaire
