examen 1, cours théorique Flashcards
définir le terme clonage
ensemble des étapes nécessaires à la production d’une molécule d’ADN recombinante
de quoi est issue la molécule d’ADN recombinante
nommer les 2 acteurs
c’est la ligation entre un fragment d’ADN exogène et une molécule d’ADN réceptrice (vecteur de clonage)
quel est le résultat d’un clonage moléculaire
création d’une molécule d’ADN chimère
définir ce que sont en soit les clones de la molécule chimère d’origine
ce sont les copies de molécules d’ADN identiques produites après la création de la chimère
quel est le but principal du clonage moléculaire
3 buts**
il est utilisé pour analyser le rôle d’un fragment d’ADN
le fonctionnement d’un gène
ou pour produire la protéine correspondante dans un autre organisme
comment utilise-t-on les bactéries lors de clonage
on insère des gènes humains codant pour une protéine voulue dans une molécule d’ADN réceptrice d’origine bactérienne; dans un vecteur
la bactérie sert de mini-usine
nommer les étapes de clonage moléculaire de l’insuline par plasmide
-ouverture du plasmide par des enzymes de restriction
-libération du gène de l’insuline par des enzymes de restriction;
les deux sont coupés, isolés et colls ensemble; ligation du gène dans l’ouverture du plasmide
on peut ensuite multiplier la molécule d’ADN et produire une grande quantité d’insuline
nommer les 5 étapes officielles du clonage moléculaire
- Élaboration d’une stratégie de clonage
- Digestion et purification du vecteur et de l’insert digérés
- Ligation de l’insert avec le vecteur
- Transformation de la bactérie avec le produit de ligation
- Sélection/criblage et identification des transformants (clones) contenant la construction recherchée
définir ce que sont des enzymes de restriction
endonucléases qui sont capables de reconnaitre et couper une séquence spécifique À L’INTÉRIEUR de la double hélice d’ADN
que signifie la digestion d’une enzyme
le fait qu’elle coupe à un endroit précis
quelle est l’utilié des enzymes de restriction
2**
elles construient les molécules d’ADN recombinantes en coupant l’ADN en fragments qui peuvent être collés ensembles dans différentes combinaisons
peuvent aussi détecter des maladies ou mutations
comment sont liés les nucléotides entre eux
par la formation de liaison phosphodiester entre le carbone 5’ d’un ose et le carbone 3’ de l’ose adjacent
par convention, quel est l’ordre de lecture de la chaine d’acide nucléique
toujours dans le sens 5’P à 3’-OH
comment se nomment les séquences reconnues par les enzymes de restriction
quelle est leur particularité
ce sont des palindromes;
séquences se lisant de gauche à droite ou droite à gauche, indiféremment
quel est le résultat d’une digestion molécule d’ADN, mm si elle est circulaire
création d’extrémités libres
nommer les 3 types de molécules pouvant être produites suite à la digestion
- avec une extrémité 3’ saillante,
- avec une extrémité 5’ saillante, ou
- à bouts francs.
définir une extrémité franche
lorsque l’enzyme reconnait une séquence de 6 nucléotides et que le site de coupure est en plein centre;
ADN coupé de facon franche, sans base qui dépasse d’un côté ou de l’autre
puisque palindrome, les 2 sont pareils
définir une extrémité saillante ou cohésive
lorsque l’enzyme ne coupe pas en plein centre la séquence reconnue, il y a création d’extensions simple brin en 5’ ou 3’
ca fait des extrémités cohésives qui peuvent être recollées ensemble
définir ce que sont les ligases
enzymes capables de reconstituer la liaison phosphodiester entre 5’-P et 3’-OH de deux nucléotides adjacents d’un brin d’ADN
la ligase peut lier quel type d’extrémités ensemble
deux extrémités franches
ou
deux extrémités saillantes COMPLÉMENTAIRES
définir ce qu’est EcoR1
enzyme de restriction très utilisé en rencherche
premier détecté dans E.coli
que reconnait EcoR1
il reconnait GAATTC et coupe la séquence en laissant des bouts cohésifs
pk les bouts créés par la digestion d’EcoR1 peuvent être religuées
pcq les bouts francs créés sont complémentaires
pk l’action d’EcoR1 est jugé de clonage bidirectionnel
puisque ce sont des bouts complémentaires qui sont créés, on peut recoller les 2 côtés
définir les plasmides
molécules circulaires d’ADN double brin
à l’état naturel dans le cytoplasme des bactéries (ADN extra-chromosomique)
comment se répliquent les plasmides au sein de la bactérie
elles se répliquent de facon autonome; indépendamment des chromosomes de la bactérie
quel gène particulier se retrouve chez quelques plasmides
et pourquoi
gène de résistance à un antibiotique ou à certains métaux lourds
permet de survivre en présence des composés toxiques
quel aspect des plasmides est important dans leur utilisation comme outil de biologie moléculaire
l’acquisition de résistance
combien de chromosomes circulaires sont présents dans les bactéries?
combien de plasmides?
plusieurs millions de paires de bases de chromosomes
quelques milliers de paires de bases de plasmides
qcqun vecteur de clonage
c’est une molécule d’ADN construite pour accueillir des fragments d’ADN exogènes, appelés inserts
ce sont des plasmides modifiés plusieurs fois
quel est le rôle des vecteurs de clonage
ils transportent des fragments d’ADN d’intérêt, d’où le nom vecteur
définir l’origine de réplication sur un vecteur de clonage
-assure la réplication autonome du vecteur dans une cellule
définir le marqueur de sélection sur un vecteur de clonage
permet de savoir quelles cellules bactériennes ont incorporé une copie du vecteur
exemple: gène de résistance à un antibio
quel est le gène résistant à l’ampicilline
gène de la b-lactamase
définir le site de clonage multiple sur un vecteur de clonage
séquence d’ADN ajouté au vecteur,
contient plusieurs sites reconnus par des enzymes de restriction, lesquelles facilitent l’introduction dirigée de fragments d’ADN exogènes dans le vecteur
quel est le critère pour introduire l’insert dans le vecteur
il doit être digéré par des enzymes de restriction COMPATIBLES AUX SITES DU SCM
expliquer pourquoi les sites de restriction doivent rester unique au sein du vecteur de clonage
pcq s’ils se trouvaient ailleurs, l’enzyme couperait le vecteur en plusieurs fragments, ce qui endommagerait les autres éléments du vecteur
que permet le marqueur de criblage
il permet d’identifier les colonies qui possèdent la construction d’ADN plasmidique recherchée;
elles différencient les cellules qui poussent sur la gélose selon une caractéristique, notamment la couleur
que permet la combinaison sélection-criblage
permet d’identifier les cellules ayant incorporé les vecteurs (croissance sur le milieu contenant un antibio), mais aussi celles comportant un vecteur AVEC un insert (couleur différente)
quelle est la méthode la plus utilisée dans les criblages
gène LacZ de l’opéron lac
les E.coli préfèrent le glucose, plus facile à décomposer que le lactose
que se passe-t-il si le lactose est le seule sucre disponible
les bactéries doivent exprimer les gènes de l’opéron lac,
-lacZ
-lacY
-lacA
transcrits en un seul ARNm, sous le contrôle d’un promoteur
que code le gène lacZ de l’opéron lac
il code la b-galactosidase, qui hydrolyse le lactose en galactose et glucose (substrats de la glycolyse)
que permet le promoteur de l’opéron lac
il est le site de liaison de l’ARN polymérase afin d’effectuer la transcription
que permet l’opérateur de l’opéron lac
c’est un site régulateur négatif lié par le répresseur Lac
va bloquer l’ARN polymérase si lié
que permet le site CAP de l’opéron lac
c’est un site régulateur positif lié par la protéine activatrice du catabolite (CAP)
il induit la liaison de l’ARN polymérase au promoteur lorsque la cellule est en stress, induit catabolisme
quelles sont les 2 conditions remplies pour qu’E.coli exprime l’opéron lac
1) le lactose est disponible
2) le glucose n’est pas disponible
comment l’opéron lac fonctionne s’il y a présence de glucose et absence de lactose
le répresseur Lac réprime la transcription de l’opéron lac en se liant à l’opérateur;
empêche la transcription de l’ARN poly
comment l’opéron lac fonctionne s’il y a présence de lactose et absence de glucose
le répresseur lac perd sa capacité à se lier à l’ADN,
l’ARN polymérase peut se lier au promoteur et effectuer la transcription de l’opéron
qcqi fait en sorte qu’en présence de lactose, le répresseur ne peut plus se lier à l’opérateur
cette inhibition est faite par l’allolactose, un isomère du lactose produit par la bactérie lorsque le lactose est disponible
il induit un changement de conformation du répresseur Lac et l’empêche de se lier à l’ADN
quels sont les 2 domaines fonctionnels composant la b-galactosidase
le peptide alpha
le peptide oméga
expliquer les 2 principes de base de l’utilisation du gène lacZ en tant que marqueur de criblage
la souche E.coli à utiliser exprime une b-galactosidase non fonctionnelle; elle encode un peptide alpha muté ou non-exprimé
OR
le vecteur plasmidique à utiliser comporte la séquence du gène lacZ comportant un peptide alpha fonctionnel!! (non-muté)
il va être introduit juste après le SCM, sans modifier le cadre de lecteur du gène
qu’arrive-t-il au gène lacZ comme marqueur de criblage s’il y a absence d’insert dans le SCM
l’expression du peptide alpha est induit avec l’IPTG, un analogue de l’allolactose (qui bloque le répresseur)
quel est le substrat de la b-galactosidase et que fait-il
c’est le X-gal; un analogue du galactose
il produit un pigment bleu
s’il y a;
IPTG-glucose
induction du gène lacZ
les 2 peptides
b-galactosidase et X-gal
comment sera colonie
elle poussera et sera bleue
s’il y a;
IPTG-glucose
induction du gène lacZ
pas de peptide alpha
donc pas de b-galactosidase
comment sera colonie
elle sera blanche
comment l’insert dans le SCM peut interrompre la traduction du peptide alpha
par l’introduction d’un codon d’arrêt de la traduction
ce qui fait en sorte qu’il n’y a pas de peptide alpha, pas de b-galactosidase et donc pas de criblage réussi
quelles colonies seront utilisées pour l’identification du clone recherché
ce sont les colonies blanches, car elles comportent une b-galactosidase non fonctionnelle à cause d’un peptide alpha muté ; LE GÈNE LACZ A DONC ÉTÉ INTERROMPU PAR L’INSERTION DU FRAGMENT D’ADN
elles indiquent que le fragment d’ADN d’intérêt a été correctement inséré dans le vecteur
quelle est la prochaine étape après le résultat des colonies blanches
on va les utiliser pour identifier le clone recherché, mais il faut CONFIRMER PAR SÉQUENCAGE
qcqun plasmide, définir
adn double brin circulaire, extra-chromosomique à l’état naturel dans le cytoplasme des bactéries qui se répliquent de facon autonome et est transmis aux cellules filles
à quoi sert un vecteur
molécule d’ADN double brin circulaire, outil d’insertion et de transport d’ADN étranger; provient de plasmide modiifé
quels sont les constituants essentiels d’un vecteur de clonage
origine de réplication
marqueur de sélection
SCM
à quoi ser un marqueur de sélection dans un vecteur de clonage
sélectionner les cellules hôtes qui ont incorporé une copie du vecteur
faites la distinction entre un plasmide et un vecteur
un vecteur peut être considéré comme un plasmide selon sa capacité à se se maintenir dans le cytoplasme bactérien, et de transmettre à ses cellules filles
un plasmide n’est pas nécessairement un vecteur puisque ce ne sont pas tous les plasmides qui peuvent incorporer et transporter un insert
comment utilise-t-on E.coli en biomol comme outil de manipulations de base
-préparer ADN plasmidique en petite ou grande quantité
-produire des protéines recombinantes
quel est le temps de division d’E.coli
20 minutes dans des conditions optimales
quelle est la définition de la transformation d’une bactérie par un plasmide
et quel est son but
action d’introduire de l’ADN plasmidique (vecteur) dans une bactérie
;; obtenir une grande quantité d’ADN en question (la bactérie répliquera l’ADN plasmidique recu comme si c’était son ADN)
nommer les 2 méthodes permettant de transformer une bactérie avec de l’ADN
1)transformation par la chaleur (méthode chimique)
2)électroporation (méthode physique)
quelle est la condition pour la transformation bactérie par un plasmide
il faut que les bactéries soient compétentes; soient aptes à laisser entrer l’ADN plasmidique
comment se fait le processus de sélection des bactéries transformées
seules les bactéries transformées pousseront sur le milieu contenant l’antibio
car elles auront recu une copie du plasmide, contenant le gène de sélection/résistance (antibio)
comment le plasmide s’intègre dans le cytoplasme de la bactérie
il y a perméabilisation de la membrane par traitement au CaCl2; ce dernier fera des trous dans la membrane par sa haute teneur en calcium
ce qui lui laisse l’entrée libre
dans le cadre du clonage, pour quelle raison faut-il utiliser des souches d’E.coli qui ne peuvent pas méthyler l’ADN
pcq la méthylation protège le génome bactérien contre les coupures des enzymes de restriction;
l’ADN plasmidique extrait ne pourra donc pas être digéré par les enzymes de restriction, qui sont incapables de digérer l’ADN méthylé
certaines souches possèdent des mutations qui diminuent leur capacité à…
nommer les 2 fonctions
à faire la recombinaison;
à activer les endonucléases
pour que le système sélection-criblage opéron lac fonctionne, que doit apporter la bactérue hôte
elle doit apporter le peptide oméga, qui s’associera avec le peptide alpha et obtiendra une enzyme active qui peut métaboliser le X-gal et former la couleur bleue
expliquer le système de complémentation alpha
comme dans la souche DH5alpha;
la partie du gène codant pour le fragment alpha est muté, sans quoi b-galactosidase serait fonctionelle, rendant impossible tout criblage
le vecteur doit fournir le peptide alpha; d’où le nom complémentation alpha
quelle est la différence entre la sélection et le criblage
une sélection résulte en la pousse des bactéries transformées seulement; dans le criblage, toutes les bactéries poussent, mais le but est de les différencier en voyant quelles colonies ont un vecteur contenant un insert dans leur SCM , de par une caractéristique différente comme la couleur
donner des raisons qui font que E.coli est très utilisé comme outil de biomol
elle a un court temps de division, on connait bien sa génétique et sa chimie, les protocoles sont simples
quelle caractéristique d’une souche bactérienne est essentielle à la réussite d’un criblage à l’aide de lacZ
une délétion d’une portion du gène lacZ codant pour la protéine alpha
quelle est la méthode d’extraction d’ADN plasmidique la plus utilisée
la mini-préparation par lyse alcaline,
appelée miniprep
nommer les étapes de l’extraction d’ADN plasmidique par miniprep
1) mise en culture d’une suspension bactérienne
2 )lyse bactérienne dans un tampon alcalin en présence de SDS et RNAse
3) neutralisation par ajout de solution saline qui précipitera la plupart des composants cellulaires autre que le plasmide
4)purification du plasmide sur une colonie d’adffinité
5) lavage et élution
6)dosage par spectrophotométrie
pk faut-il spin après chaque étape de la miniprep-lyse alcaline
afin que les fragments se lient, mais pas trop pour ne pas faire de contamination
quelle est la facon la plus courante de visualiser l’ADN sur le gel d’agarose
de le colorer avec des produits fluorescents
comme le bromure d’éthidium
que fait le bromure d’éthimidium pour colorer l’ADN
il s’intercale entre les bases de la double hélice et devient fluorescent quand il est excité par lesUV
ARN apparait sous forme de bandes oranges
quels sont les 2 fragments liés ensemble au cours d’un clonage
le vecteur et l’insert
chaque fragment est digéré et ensuite lié ensemble sous l’action de la ligase
nommer les 5 étapes du clonage moléculaire
- Élaboration d’une stratégie de clonage
- Digestion et purification du vecteur et de l’insert digérés
- Ligation de l’insert avec le vecteur<
- Transformation de la bactérie avec le produit de ligation
- Sélection/criblage et identification des transformants contenant la construction recherchée
comment le choix du vecteur à utiliser est fait
par les besoins de l’expérience, notamment la taille et la source de l’insert
l’insert obtenu par PCR est flanqué de quoi et où précisèment
de 2 sites EcoR1 (GAATTC);
un avant le codon initiateur ATG
l’autre après le codon stop TAG
quel site précède le site EcoR1 en 5’
il est précédé du site Pst1 CTGCAG
quel site suit le site EcoR1 en 3’
il est suivi du site Hind111 CCACTT et du site Sal1 GTCGAC
lors du choix des enzymes, pourquoi faut-il choisir des sites de restriction cohésifs entre eux
afin de faciliter le recollage du vecteur et de l’insert
si l’on opte pour une stratégie bidirectionnelle, quel sera le choix des enzymes
une seule et mm enzyme
ceci assure que les bouts produits sont compatibles
si l’on opte pour une stratégie unidirectionnelle, quel sera le choix des enzymes
deux enzymes
quel est le risque de la stratégie bidirectionnelle
l’insert peut se coller dans les 2 orientations, et le vecteur pourrait se refermer sur lui-mm
pourquoi est-il préférable de prendre une stratégie unidirectionnelle
les enzymes produiront des extrémités saillantes non cohésives; il y a une seule orientation possible pour introduire l’insert dans le vecteur
donc cela élimine la possibilité que le vecteur ou l’insert se referme sur lui-mm
quels sont les critères à respecter lors du choix du vecteur dans une stratégie unidirectionnelle
il faut que le SCM contienne 2 sites différents présents aux extrémités de l’insert
il faut que les sites respectent l’orientation du promoteur et la transcription 5’-3’ du gène
décrire l’étape de la digestion du vecteur et de l’insert
ils doivent être digérés séparément, avec les enzymes choisies,
soit Pst1 et Hind111
soit Pst1 et Sal1
de 2 à 17 heures de digestion
définir l’étape de purification et insert sur gel
après la digestion, le vecteur et l’insert migrent sur un gel d’agarose séparément
ils seront découpés séparément avec une lame de rasoir
le gel contenant le vecteur est coupé et l’ADN est extrait et purifié
que fait-on après avoir purifier l’ADN extrait
on suit l’analyse afin de connaitre sa concentration
on fait la mm chose avec l’insert
que faut-il faire pour liguer l’insert avec le vecteur
il faut les incuber ensemble en présence de ligase à ADN du phage T4 (catalyse la formation du lien phosphodiester)
pourquoi lors de ligation faut-il incuber une plus grande quantité d’insert que de vecteur
afin de favoriser les rx intermoléculaires et augmenter les chances de réussite de clonage
quel critère permet la sélection des transformants
l’ampicilline
quel critère permet le criblage des transformants
les colonies blanches (couleur)
quel critère permet l’amplification des transformants
la miniprep
quel critère permet l’identification des transformants
le séquencage
comment peut-on vérifier les séquences après le séquencage
en induisant l’expression de la protéine (exemple; fluorescence du GFP)
