CHAP 2; préparation d'ADN plasmidique Flashcards
définif l’objectif de ce chapitre
faire la mini-préparation d’ADN plasmidique des bactéries transfos et portant la construction pBS/GFP ou le vecteur pUC19
**isoler l’ADN plasmidique des 2 populations de bactéries transfos
pk les plasmides sont utilisés en ADN recombinant
afin de produire une protéine d’intérêt ou encore pour amplifier un fragment d’ADN ;
mm principe: insérer dans le vecteur le fragment d’ADN, puis de transférer le plasmide dans un microorganisme récepteur
nommer les 3 étapes, en ordre, de la mini-préparation plasmidique
1) lyse alcaline des bactéries et élimination des débris cellulaires
2) absorption de l’ADN sur la colonne de silice
3) Lavage et élution de l’ADN (purifié et concentré)
de quoi est fait le premier tampon de lyse utilisé et dans quel but
RNAse; permet la dégradation d’ARN de petite taille
pk veut-on se débarasser des ARN de petites tailles
ces molécules nuisent à l’analyse de plasmides, car ils peuvent cacher des fragments d’ADN de taille 0-500pb sur un gel d’agarose
nommer les composants du 2e tampon de lyse
SDS
NaOH
à quoi sert le SDS
il va solubiliser la paroi cellulaire
à quoi sert le NaOH
il va augmenter le pH, afin de dénaturer l’ADN chromosomal et aider aussi à la lyse des bactéries
nommer les composants du 3e tampon de lyse
acétate d’ammonium (ou sel semblable)
chlorhydrate de guanidine
à quoi sert l’acétate d’ammonium dans le 3e tampon de lyse
il va provoquer la précipitation des protéines et de l’ADN chromosomal;
une fois ce précipité enlevé il ne reste que les acides nucléiques de petite taille (plasmides)
à quoi sert le chlorhydrate de guanidine dans le 3e tampon de lyse
isoler l’ARN grâce à sa capacité d’inhiber les RNases, dénaturer les protéines et les nucléoprotéines surtt, et faciliter la liaison de l’ADN plasmidique au support en silice de la colonne
pk utilise-t-on une colonne en silice ou fibre de verre
elle va lier sélectivement l’ADN plasmidique ou un autre acide nucléique;
pour faire lier l’ADN à la silice, une solution à forte concentration en sels est utilisée
**ADN retenu par les fibres de verre
pk utilise-t-on des alcools come l’éthanol
pour la préparation du tampon de lavage de l’ADN;
retenu ensuite par adsorption sur la colonne de silice
quelles sont qq précautions à prendre lors des manipulations
-tampon 1 doit contenir RNase et être maintenu sur glace
-éthanol doit faire partie de la solution de lavage
-porter des gants
-pas de précipités dans les solutions
on effectue un dosage d’ADN plasmidique au spectrophotomètre Nanodrop;
quelle est la valeur attendue pour le ratio 260/230 si l’échantillon est pur de matière organique
entre 2 et 2.2
on effectue un dosage d’ADN plasmidique au spectrophotomètre Nanodrop;
quelle est la valeur attendue pour le ratio 260/280 si l’échantillon est pur de protéines
1.75 et 2.1
si le spectrophotomètre biophotometer est utilisé, comment peut être évalué la concentration
formule: A= e c l
A=260nm
e= 0.020 (ADN double brin)
l= 1 cm (trajet optique)
on calcule ainsi la concentration de l’échantillon
Avant de commencer l’étape 4 de la lyse alcaline des bactéries, on doit s’assurer que la culture bactérienne donne une valeur de densité optique (DO) à 600 nm
quelle est cette valeur
entre 1 et 2,5
si la culture bactérienne donne une valeur de densité optique (DO) à 600 nm inférieure à 1
que cela sgnifie-t-il
la densité bactérienne est insuffisante pour atteindre le rendement minimal;
on doit poursuivre sa croissance
si la culture bactérienne donne une valeur de densité optique (DO) à 600 nm supérieur à 2.5
que cela sgnifie-t-il
suspension est trop dense pour de la transfo bactérienne;
il faut la diluer
