metoda po bradfordu

Question 1

kvantitativno določanje proteinov metode (posredne in neposredne)

Answer 1

NEPOSREDNE
UV spektrofotometrija (Trp in Tyr največ pri A280)

POSREDNE
kolorimtrične metode
raztopini proteina dodamo nek reagent → kemična reakcija → nastanek obarvane spojine
umeritvena premica !!!!
-biuretska
-Lowrijeva
-Bradfordova

Question 2

UV spektrofotometrija
Beer-Lambertov zakon

Answer 2

gledamo kje je največji molarni ekstincijski koeficient [103/ M cm]
A280= e280 x c x l
absorbanca = molarni eksrincijski koeficient x množinska konc. x dolžina kivete

triptofan, tirozin največ pri 280nm
fenilanalin pri 220nm

-nedestruktivna metoda
-vpliv sestave proteina
-sestava pufra!!

pozor!: tudi če je pri raztopini DNA vrh pri 260 je še vedno lahko kontaminirana s proteini, saj absorbira 10x več kot raztopina proteina z isto masno koncentracijo
vrh pri 280nm je skrit v vrhu pri 260nm
če sumimo na kontaminacijo DNA vedno posnamemo spekter

Question 3

poseben primer UV spektrometrije

Answer 3

NanoDrop
ni kivete
majni volumni
širok razpon koncentracij

Question 4

kolorimetrične metode
umeritvena krivulja
znan protein

Answer 4

za določanje koncentracije potrebujemo UMERITVENO KRIVULJO (premica)
za znane koncentracije znanega proteina izmerimo absorbanco pri želeni
λ
-krivulja ni linearna v celotnem območju
-narejena mora biti v ustreznem območju
-enaki pogoji kot pri merjenju vzorca
-pozorni moramo biti pri izbiri znanega proteina

→ najpogosteje znan protein BSA goveji serumski albumin
-globularni protein
-ga je veliko (poceni)

idealna bi bila uporaba proteina, ki je čimbolj podoben našemu

Question 5

Biuretska metoda
λ
princip
meja detekcije
prednosti
slabosti

Answer 5

pretein + Cu’2+ → vijolično obarvan kompleks
merimo pri λ med 540 in 560 nm

princip: Cu’2+ v bazičnem v prisotnosti K, Na-tartrata tvori s peptidnimi vezmi vijolično obarvan kompleks
K, Na-tartrat za stabilizacijo Cu’2+, da se ne obori v alkalnem → peptidna vez nato izpodrine tartrat

meja detekcije: 5-160 mg/ml
prednosti: za vse proteine
slabosti: nizka občutljivost, neobstojnost reagentov, inferenza z drugimi snovmi npr. (urea)

Question 6

Lowrijeva metoda
λ
princip
meja detekcije
prednosti
slabosti

Answer 6

temelji na biuretski metodi
protein + Cu’2+ → vijolično obarvan kompleks
→ redukcija (Folin-Ciocalteaujev reagent) → molibdensko modrilo
merimo pri λ 750nm

princim: redukcija molibdenovih ionov preko kompleksa Cu’2+ peptidna vez
donorji e pri redukciji so koordinacijske vezi med Cu in peptidnimi vezmi ob Tyr

meja detekcije: do 10 μg/ml
prednosti: precejšnja občutljivost
slabosti: moti jo veliko snovi (Tris, HEPES, saharoda, glicerol), pH med 10 in 10,5, protein mora imeti dovolj Tyr

Question 7

metoda po Bradfordu
λ
princip
meja detekcije
prednosti
slabosti

Answer 7

protein (ak-ostanki z bazičnimi in aromatskimi stranskimi skupinami) + Coomassie brilliant blue → kompleks protein-barvilo → modra obarvanost
najbolj absorbira pri 595 nm
ko narašča koncentracija protein gre od 470nm do 595nm

princim: vezava CBB na proteine v kislem (na + in aromatske stranske skupine ak ostankov)

meja detekcije: 1-200μg/ml
prednosti: hitrost, poceni, visoko specifična za proteine, občutljivost, kompatibilna z mnogimi snovmi
slabosti: nelinearnost pri visokih koncentracijah