določanje števila cisteinov

Question 1

kateri reagent uporabljamo
pri kateri valovni dolžini kvantificiramo

Answer 1

ELLMANOV REAGENT oz. DTNB
reakcija Ellmanovega reagenta s sulfhidridno vezjo
(citein vsebuje SH vez)

DTNB + R-S (prost proteinski ostanek) → mešan disulfid + TNB
TNB v alkalnem rumene barve

kvantificiramo preko A412

Question 2

umeritvena krivulja za kvantitativno določanje cisteinov postopek

Answer 2

raztopina cisteina z znano množinsko koncentracijo
(pogoji morajo biti enaki kot pri neznanem proteinu, zato dodamo Tris/HCl za pH 8 in ureo - ta denaturira naš protein)
+ Ellmanov reagent
meritev absorbance pri 412nm

na osnovi meritev izdelava umeritvene krivulje

Question 3

določitev št. prostih cisteinov

Answer 3

vzorec neznanega proteina (množinsko konc. poznamo)
protein denaturiramo z ureo (protein ostane topen)
ker je protein zvit ga denaturiramo, da so vsi proti cisteinski ostanki dostopni
dodatek Tris/HCl pH 8
+ Ellmanov reagent
meritev A412

na podlagi umeritvene krivulje odčitamo konc. prostih Cys

število prostih Cys = c(Cys)/ c(protein)

Question 4

določitev števila vseh cisteinov v proteinu

Answer 4

protein + urea + Tris/HCl pH6
+ reducent ditiotreitol DTT (redukcija disulfidnih vezi)

→ odstranitev reducenta
1) + TCA (trikloroocetna kislina)
oborimo protein, reducent ostane v raztopini
2) centrifugiramo in odstranimo supernatant
3) oborjen protein raztopimo v kisle
+ urea + NaOAc pufer pH3

+ Ellmanov reagent (v alkalnem, zato dodaj nazadnje, da se disulfidne vezi ne tvorijo ponovno)
meritev A412

na podlagi umeritvene krivulje odčitamo konc. vseh Cys

število vseh Cys = c(vseh Cys)/ c(proteina)

Question 5

izračun števila disulfidnih vezi

Answer 5

(št. vseh - št. prostih Cys) / 2