izolacija kromosomske DNA in hiperkromni efekt Flashcards
struktura DNA
nukleozid/ nukleotid
kaj stabilizira dvojno vijačnico
DNA:
veliki in mali žleb
AT: 2 vodikovi vezi
GC: 3 vodikove vezi
purinske paze: A in G
pirimidinske baze: C, U in T
nukleozid= baza + pentoza
nukleotid= baza + pentoza + (3) fosfat
stabilizacija dvojne vijačnice: STACKING INTERAKCIJE
= interakcije med π elektronskimi oblaki (med “naloženimi” bazami)
bazno parjenje nima velikega vpliva
kvantifikacija DNA
najenostavneje spektrofotometrično
velja Beer-Lambertov zakon A260 = e260 c l
A260=1 → 50 μg/ml
absorbira 20x močneje kot protein pri enaki masni koncentraciji
ssDNA še bolj obsorbira kot dvoverižna
povprečna molska masa enega baznega para M= 650g/mol
y= M x c
pri proteinih
A280=1 →1 mg/ml
določevanje čistosti DNA
razmerje A260/A280
čista DNA: A260/A280= 1,8
lažje je detektirati kontaminacijo proteinskega vzorca z DNA kot obratno
DNA kontaminiran s proteini: proteini ne vplivajo tako močno na premik vrha
denaturacija DNA
denaturacija DNA= razprtje dvojne vijačnice
-prekinitev vodikovih vezi med bazami v baznih parih
-izpostavitve baz topili → spremenjene absorbcijske lastnosti zaradi drugačnega okolja (nekoliko večji e)
denaturacija DNA v kislem/bazičnem
bazično:
deprotonacija donorjev H-vezi → reverzibilen razpad dvojne vijačnice
(RNA ireverzibilno, pride do hidrolize)
kislo:
protonacija akceptorjev H-vezi → ireverzibilen rapad
v kislem pride do hidrolize DNA in RNA, pH<1
spojina se razcepi z vgraditvijo vode
depurinacija DNA v kislem
zraven denaturacije pride še do DEPURINACIJE
=cepitev beta-N-glikozidne vezi med ribozo in purinsko bazo
sproščen G ali A imata še višji ekstinkcijski koeficient pri 260nm → še višja A260
A260(kislinska denaturacija) > A260(bazična denaturacija)
temperaturna denaturacija DNA
med 60 in 80 C
50% denaturiranost → temperatura tališča Tm
na Tm vplica:
-dolžina DNA (zipper effect)
daljša kot je DNA, več interakcij je potrebno hkrati prekiniti, višja Tm
-delež CG parov
več CG, višja Tm
-koncentracija soli (Na+)
več soli, boljše blaženje med fosfatnimi skupinami ogrodja, večja stabilnost dsDNA
Tm= 81,5 + 0,41 (%CG) + 16,6 log[Na+]
za koliko % se poviša A260 ob denaturaciji
za 30 do 40%
praktični vidik termične denaturacije DNA
PCR
verižna reakcija s polimerazo
reakcijska zmes vsebuje:
-matrična DNA
-par začetnih oligonukleotidov
-zmes dNTP
-termostabilna DNA polimeraza
-reakcijski pufer (Mg ioni)
vpliv hitrosti ohlajanja denaturirane DNA na popolnost renaturacije
če DNA zelo na hitro ohladimo→ nastanek nepopolnih nukleacijskih regij → nepopolna renaturacija
DNA POČASI ohlajamo→ popolna renaturacija
vpliv kompleksnosti zaporedja na hitrost renaturacije
DNA z zaporednjem z nizko kompleksnostjo se hitreje renaturira kot taka z visoko kompleksnostjo zaporedja
vaja:izolacija kromosomske DNA
goveja vranica → homogenizacija (teflonski homogenizer) v citratnem pufru (bolj kislo območje, na ta način odstranimo Mg2+ ione, s tem zmanjšamo delovanje nukleaz, saj nočemo da nukleaze razgrajujejo DNA)
centrifugiramo, jedra se posedejo, supernatant zavržemo
usedlina + NaCl (resuspendiramo)
+ kloroform/izoamilni alkohol
s pomočjo teh dveh topil ekstrahiramo proteine
proteini bodo v organski fazi kloroform/izoamilalkohol
kloroform večja gostota kot voda
centrifugiramo, za naprej uporabimo zgornjo vodno fazo
supernatant + ledenomrzli etanol
znižamo dielektrično konstanto DNA
DNA navijemo na palčko
DNA raztopimo v razt. NaCl
vaja: denaturacija DNA
TEMPERATURNA DENATURACIJA
DNA inkubiramo pri različnih temp.
takoj postavimo na led (na sobni temp. se zlaga nazaj v dvoverižno, pri nizki temp. energijski minimum, regije se ne najdejo)
ko se ohladi → A260
DENATURACIJA V KISLEM BAZIČNEM
dodamo pufre z različnimi pH vrednostmi
izmerimo A260 narišemo krivuljo
zakaj se A260 pri denaturaciji poveča
baze so bolj izpostavljene topilu
