ionsko izmenjevalna kromatografija Flashcards
ionsko izmenjevalna kromatografija
temelji na privlačnih elektrostatskih interakcijah med nasprotno nabitimi delci
molekule se vežejo na nasprotno nabito stacionarno fazo
vzorec ne sme vsebovati soli oz. zelo nizka koncentracija
npr. + nabit nosilec
močno - in šibko - nabit protein se vežeta na nosilec
spiranje nevezanih molekul
povišamo koncentracijo soli- elucija šibko vezanih molekul
s soljo izpodrinemo protein iz nosilca
še povišamo koncentracijo soli- elucija močno vezanih molekul
različni proteini → različna izoelektrična točka
npr. pI→ 3,5
ima več karboksilnih skupin, bolj moramo nakisat, da protein izgubi naboj
stacionarna faza pri ionsko izmenjevalni kromatografiji
jakost ionskih izmenjevalcev
ANIONSKI izmenjevalci
+ nabiti, vežejo anione
šibki: DEAE dietilaminoetil
močni: QAE kvartni aminoektil
KATIONSKI izmenjevalci
- nabiti, vežejo katione
šibki: CM karboksimetil
močni: SP sulfopropil
razlika med močnimi in šibkimi izmenjevalci je vrednost pKa
močni izmenjevalci nabiti v širokem območju pH (majhen pKa)
šibki izmenjevalci nabiti v ozkem območju pH (velik pKa)
vezava na močne ionske izmenjevalce je močnejša
izbira stacionarne faze in pufra
STACIONARNA FAZA
določa, kakši ioni se bodo vezali nanjo
kationski in anionski izmenjevalci
VREDNOST pH PUFRA (MOBILNE FAZE)
določa ionsko obliko proteinov
nizek pH→ kationska oblika
visok pH→ anionska oblika
izbira pH pufra
pH vpliva na:
-naboj proteina
-stabilnost in topnost proteina
pH blizi pI →lahko pride do agregacije in obarjanja
ekstremne vrednosti pH→ izguba funkcionalnosti, denaturacija proteina
splošno pravilo: delamo pri pH, ki je vsaj za 1 enoto oddaljen od pI
potek izvedbe ionsko izmenjevalne kromatografije
-ekvilibracija
kolono speremo z pufrom z izbrano vrednostjo pH ob nizki ionski jakosti
-vezava
na kolono nanesemo vzorec, ki je v enakem/podobnem pufru
(predpriprava vzorca: koncentriranje načeloma ni potrebno, ker volumen vzorca ne igra tako pomembne vloge kot pri GF)
-spiranje
z enakim pufrom speremo nevezane proteine (dokler A280 ne pade)
ne smemo preveč spirati, saj so proteini ravnotežno vezani
-elucija
vezane proteine eluiramo s pufrom z višjo ionsko jakostjo
nočemo vseega na enkrat. delamo stopenjko oz. gradientno
lahko tudi s spremembo pH
zgubi se naboj in gr p koloni navzdol, nevarno: pridemo do pI, protein se obori, kolona zamaši
načini elucije vezanih proteinov
-izokratska elucija
eluiramo z začetnim pufrom
ker je vezava preko ionskih interakcij ravnotežne narave, vezani proteini počasi potujejo proti iztoku kolone
slabost: velika količina pufra, počasi, slaba elucija
-elucija s sprememb pH
sprememba pH →sprememba nabojev →sprememba moči vezave
-elucija s povišano ionsko jakostjo
povišanje ionske jakosti →tekmovanje za vezavo na kolono → elucija proteina ta način se v praksi največ uporablja
BANA test
BANA test za katepsin B
izoliramo: katepsin B (cisteinska peptidaza- v aktivnem mestu Cys)
cepi substrate, ki vsebujejo peptidno vez
BANA= substrat ki vsebuje peptidno vez
dodamo tudi DTT (reducent), ki aktivira katepsin B
po določenem času reakcijo prekinemo s p-kloromerkuribenzojsko kislino, ki ireverzibilno inhibira katepsin B
dodamo sol Fast Garnet= prekinjevalni reagent
kjer je več encima je nastalo več produkta, ki je obarvan kompleks→ merimo A520
- vaja: ionsko izmenjevalna kromatografija
naboj katepsina
-speri nosilec s startnim pufrom
-nanesi vzorec
-speri z začetnim pufrom
-zbiraj frakcije
-speri z začetnim pufrom z 25mM NaCl, zbiraj frakcije
-speri z začetnim pufrom z 150mM NaCl, zbiraj frakcije
-speri z začetnim pufrom z 600mM NaCl, zbiraj frakcije
-speri z začetnim pufrom→ekvilibracija kolone
-vsem vrakcijam določi A280
katepsin B ima pri pH 5 pozitivni naboj
-dodaj fosfastni pufer, pH 6 s cisteinom (katepsin B ima v aktivnem mesti cistein, zato ga moramo dodati, če želimo, da bo katepsin aktiven)
-dodaj frakcije
-inkubiraj 5min
-dodaj BANA, inkibiraj 10min
-ustavi reakcijo z prekinjevalnim reagentom
-pomeri A520 proti slepemu vzorci
