gelska filtracija Flashcards
osnovni princip kromatografije
različne interakcije med komponentami zmesi in stacionarno fazo
potovanje mobilne faze
različna hitrost potovanja komponent
ločitev komponent
tekočinska kolonska kromatografija pojmi
eluent= mobilna faza (vzdrževanje molekul vzorca v željenem stanju)
vzorec
stacionarna faza na nosilcu
eluat= kar priteče ven
zbiraš frakcije
stacionarna faza npr naboj na kroglicah
nosilec so kroglice
nosilec (matriks)
agaroza (sepharose)
celuloza
dekstran (Sephadex)
poliakrilamid (Sephacryl)
polistiren
silikagel
mehanizmi ločbe
-absorbcija (se vpije)
-adsorbcija (nekaj se prime na površino)
ionske interakcije→ ionsko izmenjevalna kromatografija
afiniteta→ afinitetna
hidrofobne interakcije→ hidrofobna
-velikost
gelska filtracija
nosilec so porozne kroglice, pore kroglic različno velike in napolnjene s tekočino
molekule proteina ne morejo v pore
ioni soli lahko, imajo več prostora da se razporedijo→ počasnjše potovanje
večja stopnja zamreženosti gela→ manjše pore na površini kroglic
npr. območje ločevanje 0-700 Da
vse kar je večje bo šlo takoj mimo
elucijski diagram
x os: čas/ volumen
y os: absorbanca (280nm)
dobimo več vrhov
ploščina vrha je povezana z količino molekul (integral)
pomembni dejavniki pri ločljivosti pri gelski filtraciji
dolga in ozka kolona (manjši pretok)
konstanten pretok
majhen volumen vzorca (če ne bodo prvi ioni soli ujeli zadnje molekule proteina)
nizka viskoznost vzorca
pravilna izbira nosilca in pufra: nič se ne sme oboriti, saj se kolona zamaši
gelska filtracija kvantitativen opis
Vt
Kav
Vt = Vx + V0
celoten V kolone= skupen V kroglic + prosti volumen
Kav= porazdelitveni koeficient
Kav= (Vel-V0)/(Vt-V0)
neodvisen od dimenzij kolone
odvisen od proteina in nosilca
volumen vzorca naj ne preseže 5% celotnega volumna kolone (če ne bo ločljivost slabša)
ne želimo hidrofobnih in ionskih interakcij med vzorcem in nosilcem:
hidrofilni nosilci, nosilci brez naboja
pufri z višjo ionsko jakostjo
dodatek soli prepreči šibke Wan der Waalsove interakcije
praktični vidiki gelske filtracije
-ločevanje različno velikih makromolekul v preparativne namene
-določanje molekulske mase globularnih proteinov
nanesem proteini z znanimi molekulskimi masami, narišemo umeritveno premico
nato skozi kolono spustimo še neznan protein
-razsoljevanje vzorcev, menjava pufra
gel z majhnimi porami:
proteinske molekule ne morajo vstopati v pote →majhen Vel
ioni soli vstopajo v pore→počasno potovanje →velik Vel
kako določimo koliko česa je v frakcijah po kromatografiji
-encimski test, elektroforeza, elisa
-A280 posameznih frakcij
preko A280 sklepamo količino proteinov
(z gelsko filtracijo odstranimo amonijev sulfat)
-detekcija NH4+ ionov z Nesslerjevim reagentom → obarvana spojina
Beer-Lambertov zakon
A280= e280 x c x l
e280= molarni ekstinkcijski koeficient
c = množinska koncentracija
l = dolžina optične poti
kaj se običajno pri gelski izključitveni uporablja za mobilno fazo
pufer z višjo ionsko jakostjo
nočemo interakcij med proteinom in stacionarno faz
vaja 3. razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo
-gel prenesi v kolono, počakaj da se posede
-spiraj z mobilno fazo (pufer 0,6M NaCl)= ekvilibracija
-vzorec (obarjanje s 40% nasičenjostjo amonijevega sulfata) najprej centrifuguraj: na kolone nikoli ne nanašamo motnih vzorcev
-ko mobilna faza ponikne v gel
nanesi malo vzorca
-ko ponikne najprej daj malo nato pa do vrha napolni z mobilno fazo
-zbiraj frakcije
-izmeri A280
-dodaj Nesslerjev reagent za določanje amonijevih ionov
