izolacija plazmidne dna in agarozna elektroforeza Flashcards
plazmidna dna
majhna, gola, zunajkromosomska DNA
ponavadi krožna dsDNA
plazmidi najpogostejši v bakterijah (najdemo jih tudi v arhejah in evkariontskih celicah)
ena ali več kopij na delico
1 do 1000 kb (ponavadi <10 kb)
3 kb so približno 2MDa
(1 bazni par je okrog 650 Da)
topološke oblike plazmidne DNA
kako do tega pride
katalizator predvorbe je
plazmidna DNA je ponavadi v dodatno zviti obliki
(supercoiled DNA, supercoiling)
kako pride do dodatnega zvitja?
ko se dna odvija se dodatno zvije
pretvorbo med topološkimi oblikami katalizirajo topoizomeraze
(cepijo vez med fosfatno skupino in deoksiribozo v ogrodju DNA)
dodatno zvitje je pomembno pri:
-podvojevanju DNA in transkripciji
-povečanju kompaktnosti DNA
vloga plazmidov v bakterijah
dodatna DNA je načeloma za celico breme (energija + osnovni gradniki)
plazmidi nudijo celicam prednost pri preživetju v določenem okolju
(odpornost proti antibiotikom, sinteza toksinov, uporaba nekega specifičnega vira energije)
pri podvojevanju celic hčerinske celice dobijo kopijo plazmida
dodatno:
konjugacija (samo nekateri plazmidi)
transdukcija (s pomočjo virusa)
plazmid v laboratoriju
plazmide uporabljajo kot VEKTORJE za vnos DNA z želenim zapisom v celice
vektor= prenašalec, ki omogoča vnost želene DNA v gostiteljsko celico
(npr. plazmidi, virusi, bri bakterijah bakteriofagi, umetni bakterijski BAC in kvasni kromosomi YAC)
selekcijski označevalci= plazmidni geni, ki posredno omogočajo preživetje le tistim celicam, ki nosijo te plazmide
molekulsko kloniranje
plazmid ima zapis za protein x in zapis za odpornost proti antibiotiku
tranformacija (skozi celično membrano je vstavljen v bakterijske celice)
razmaz na agarne plošče s antibiotikom
zrastejo samo kolonije bakterij, ki vsebujejo plazmid
z eno kolonijo inokuliramo tekoče gojišče z antibiotikom
stresanje pri temp. 37C
celice zberemo s centrifugiranjem
homogeizacija in čiščenje proteina x
postopki priprave rekombinantnih plazmidov
plazmid režemo
DNA z želenim fragmentom režemo z restrikcijskama endonukleazama (en lepljivi, en topi konec)
ligacija z DNA-ligazo
regijo DNA ki jo želimo vključiti pomnožujemo z postopkom PCR
izolacija plazmidne DNA iz bakterij
osnovni koraki:
razbitje (liza celic)
dodatno čiščenje plazmidne DNA
dva osnovna načina:
- encimska liza (za gram + , debel sloj peptidoglikana, ena membrana)
- alkalna liza (za gram -, tanek sloj peptidoglikana, dve membrani)
tudi pri gram - lahko uporabljamo encimsk lizo, vendar moramo vsaj delno raztopiti zunanjo membrano (dodatek detergenta)
encimska liza
ENCIMSKA LIZA (gram +)
usedlino resuspendiramo v raztopini, ki vsebuje
-Tris → pH
-saharozo → izotoničnost
-Triton X-100 (neionski detergent)
-EDTA → inhibicija nukleaz (dvovalentni ioni)
dodatek lizocima
cepitev glikozidne vezi v peptidoglikanu → naluknjanje peptidoglikanske ovojnice
majhne plazmidne molekule izstopijo skozi nastale “luknje”
segrejemo → inaktivacija lizocima
celice centrifugirama, plazmid v supernatantu pa dodatno očistimo
alkalna liza
ALKALNA LIZA (gram -)
resuspendiramo v raztopini:
-Tris → pH
-EDTA → inhibicija nukleaz (dvovalentni ioni), destabilizacija lipopolisaharidnega sloja
dodatek:
-NaDS (SDS) → raztapljanje membrane, denaturacija proteinov
-NaOH → denaturacija dsDNA v ssDNA (ostane prepletena)
dodatno čiščenje: K-acetat + ocetna kislina
-renaturacija plazmidne DNA
-nastanek KDS (slabo topen) kalijev dodecil sulfat: obarjanje proteinov v katere se ujame kromosomska DNA→ sediment
v supernatantu imamo plazmid
dodatno čiščenje z obarjanjem DNA
- dodatek Na-acetata (ioni Na delujejo kot proti-ioni)
DNA neg napita, ti ioni poz. in se vežejo na dna - ddatek etanola ai 2-propanola (zniža se dielektrična konstanta topila) → slabša topnost DNA, obarjanje
- centrifugiranje → DNA je v usedlini
- spiranje usedline z 70% etanolom
- sušenje usedline
raztapljanje DNA v pufru TE
-TrisHCl pH 8 → dobra topnost DNA
-EDTA → preprečuje delovanje DNaz
elektroforezna analiza DNA
-pri pH 8 → DNA je negativno nabita
potuje proti anodi (+)
-ločitev le na osnovi velikosti (dolžine) in oblike molekul
-zaradi velikosti DNA uporaba manj zamreženih agaroznih gelov
agarozna gelska elektroforeza = AGE
elektroforeza DNA priprava vzorca
Raztopini DNA dodamo:
nanašalni pufer:
-saharoza, glicerol ali fikol → da raztopina potone v žepek (večja gostota)
-barvili bromfenol-modro in ksilen-cianol → spremljanje poteka elektroforeze
bromfenol modro potuje hitreje kot ksilen-cianol
lestvica velikosti: nanesemo zmes linearnih fragmentov DNA znane velikosti
detekcija DNA v agaroznem gelu
barvilo etidijev bromid
se integrira v DNA (zato rakotvoren)
etidijev probim fluorescira
310nm, emisijski je 590nm
etidijev bromid dodamo v gel med njegovo pripravo, lahko pa gel po končani elektroforezi inkubiramo v raztopini etidijevega bromida
gledamo pod UV svetlobo
elektroforeza plazmidne DNA
oblike plazmidov
-sproščena oblika
-linearizirana oblika (ta edina potuje enako hitro kot znani fragmenti DNA)
-dodatno zvita oblika (najhitreje potuje)
zakaj pri izolaciji DNA iz E. coli uporabimo STET pufer in lizocim
e. coli je gram negativna
STET
S saharoza: izotoničnost
T Triton X-100: detergent, solvatira membrane
E EDTA: veže dvovalentne kovinske ione Mg2+ iz DNaz in tako prepreči njihovo delovanje
T Tris/HCl: vzdržuje pH 8, kjer je DNA negativno nabita
lizocim: ustvari vrzeli v peptidoklikanu (razbijemo c. steno)
