Imunološke metode Flashcards
kakšna vrsta detekcije proteinov po elektroforezi
specifična detekcija
→ imuno detekcija, specifična protitelesa
kaj so protitelesa, antigeni
PROTITELESA= glikoproteini, nastanejo kot odziv telesa na prisotnost tujka
dve vezavni mesti za antigen
ANTIGEN= tujek, proti kateremu molekule imunskega odziva tvorijo protitelesa
v osnovi so antigeni večje molekule:
-proteini
-nukleinske kisline
-lipidi
protitelesa
zvitje
regiji
verigi
imunoglobulinsko zvitje posameznih domen
regiji Fab in Fc sestavljata protitelo oblike Y
sestavljeni iz dveh identičnih težkih in lahkih verig, ki jih povezujejo disulfidne vezi
variabilni domeni težke in lahko verige (Vh in VL) z šetimi hipervariabilnimi zankami tvorita vbočeno vezavno mesto za anigen
monoklonska in poliklonska protitelesa
kje se sintetizirajo
protitelesa se sintetizirajo v limfocitih
MONOKLONSKA
vsak limfocit zmožen izdelovat le eno vrsto protiteles in vsako prepoznava le eno antigensko dterminanto (en epitop)
taka protitelesa so monoklonska- pridobljena iz ene celične linije
POLIKLONSKA
mešanica protiteles
več različnih protiteles, spoznajo različne epitope istega antigena
praktična uporaba protiteles
-detekcija proteinov na membrani po prenosu Western
-afinitetna kromatografija (imobilizirana protitelesa)
-detekcija proteinov po točkovnem prenosu
-fluorescenčna mikroskopija
-ELISA
detekcija po western prenosu
zanima nas ali se v mešanici proteinov nahaja iskan protein
najprej ločimo z SDS-PAGE
barvanje s Coomassie Brilliant Blue pobarva vse proteine
→ specifična detekcija s protitelesi
vendar moramo izvesti prenos na membrano ker gel ni primeren (nedostopnost antigenov)
detekcija protiteles, vezanih na nek antigen
NEPOSREDNA DETEKCIJA
protitelesa morajo biti konjugirana (vezano nekaj da prepoznamo prisotnost antigena)
to so primarna protitelesa
POSREDNA DETEKCIJA
snov, ki omogoča detekcijo vezana na sekundarno protitelo, ki prepozna primarno
ta snov najpogosteje encim HRP (hrenova peroksidaza)
tetrametilbenzidin (topen) + peroksidaza → oranžen netopen produkt
HPR omogoča tudi luminiscenčno detekcijo (sprošča se svetloba → detektiramo na filmu)
točkovni prenos
zanima nas samo ali vzorec vsebuje nek določen protein
nujno: pozitivna, negativna kontrola
lahko posredno, neposredno
vzorce nakapljamo na membrano
proteini se na membrano vežejo preko močnih kovalentnih interakcij
!!tudi protitelesa bi se vezala, zato je treba vedno pred nanosom protiteles membrano BLOKIRATI
zasedemo vezavna mesta na membrani, kamor bi se nespecifično vezala protitelesa
npr. BSA goveji srumski albumin
fluorescenčna mikroskopija
detektiramo:
-antigene v fiksiranem vzorcu preko protiteles, konjugiranih s fuorescenčnim barvilom
-vnesemo zapis za proteine s fluorescenčnim proteinom
proteine moramo fiksirati s formaldehidom, potem lahko odstranimo membrane
formaldehid reagira z proteini, kih fiksira in kovalentno poveže
ELISA
ELISA= encimoimunski test
4 tipi:
neposredna
posredna
neposredna sendvič
posredna sendvič
izvajamo v mikrotitrskih ploščah
intenziteta barve sorazmerna z količino antigena
- vaja: imunološke metode
detekcija govejih IgG v siru
nitrocelulozna membrana + homogenat (vzorec, ovčji, kravji sir + 0,15M NaCl)
membrano blokiramo (jajčni albumin)
inkubacija v razt. protiteles (protitelesa proti govejim IgG)
detekcija (hrenova peroksidaza pretvori reagent v barven produkt)
peroksidaza katalizira oksidacijo 4-kloro-1-naftola do vijoličasto obarvanega produkta
