homogenizacija in obarjanje Flashcards
polimerizacija proteinov
polimerizacija= odcepi se voda
aminokisline (polimerizacija) → polipeptidna veriga iz aminokislinskih ostankov
sekundarna struktura aminokislin
kje so vodikove vezi
osnovni elementi
vodikove vezi med NH in CO skupinami peptidnih vezi
osnovni elementi:
-vijačnice→Helix
-nagubane površine→ Beta-Sheet
-klobčiči→ Coli
solni mostički posebej močni v nepolarnem okolju- dielektrična konstanta
stranske skupine aminokislinskih ostankov, ki so lahko v ionski obliki
pKa v kislem:
aspartat (karboksilna skupina)
glutamat (karboksilna skupina)
imidazolni obroč histidina
pKa v bazičnem:
cistein (sulfhidridna skupina)
tirozin (fenolna skupina)
lizin (amino s.)
arginin (amino s.)
obarjanje proteinov
pogosto neželen pojav
v nekaterih primerih namenoma, tekom izolacije→ oborimo protein ali oborimo nečistoče
-IREVERZIBILNO
(oborimo nečistoče)
nepovratno, porušimo 3D strukturo
agregacija (združitev) denaturiranih molekul preko izpostavljenih hidrofobnih regij
ne moremo več raztopiti (razen v organskih topilih, detergentih)
ekstremne vrednosti pH, segrevanje, organske spojine, ioni težkih kovin, stresanje
-REVERZIBILNO
povratno
3D struktura se ohrani, protein lahko ponovno raztopimo
odtegnemo hidratacijski ovoj okoli proteinskih molekul→ molekule se nalagajo druga na drugo, tvorijo skupke
sprememba pH, močno povišana ionska jakost
reverzibilno obarjanje: pH
izoelektrična točka
celokubni naboj odvisen od pH topila
kislo: protonirane amino skupine→ +
karboksilne skupine→ 0
bazično: deprotonirane karboksilne skupine→ -
protonirane amino skupine→ 0
izoelektrična točka (pI)= pH, pri kateri je celokupni naboj proteina enak 0
denaturacija pri ekstremnih vrednostih pH
v malo bazičnem ali malo kislem protein najbolj topen (polarnost) molekule se odbijajo med sabo
reverzibilno obarjanje z dodatkom soli
najpogosteje uporablja amonijev sulfat (ne denaturira večine proteinov)
izvaja frakcionarno obarjanje (najprej se bo oboril najmanj topen protein)
tri faze:
-vsoljevanje: topnost proteina z naraščanjem konc. soli raste
-največja topnost proteina
hidratacija soli in proteina
-izsoljevanje
manj proste vode, ki bi solvatirala sol
težnja po agregaciji se poveča→ obarjanje
najprej se oborijo proteini z veliko hidrofobne površine
ireverzibilno obarjanje: kaotropne spojine/ioni
vplivajo na vodikove vezi in s tem na zvitje polipeptidne verige: denaturacija
reverzibilno obarjanje: organska topila
organska topila znižajo dielektrično konstanto
manjša dielektrična konstanta:
močnejše privlačne sile med nabitimi delci
večji privlak med proteini
šibkejše interakcije med temi deli in vodo
večji proteini (imajo več nabitih regij)→ potrebna je nižja konc. organskega topila
več kot ima nabitih AK, hitreje se obori
menjava pufrov in razsoljevanje
če želimo zamenjati pufer ali pa odstraniti sol
(pred ionsko izmenjevalno kromatografijo odstranimo sol in spremenimo ppH, pred afinitetno kromatografijo ustvarimo primerne pogoje za vezavo liganda)
na valjo tri metode:
-dializa
-gelska filtracija (velikostna izključitvena kromatografija)
-ultrafiltracija
dializa
dializno črevo: prepušča samo majhne topljence, večje (proteine) pa ne
polprepustna membrana
slabosti: dolgo traja, velik voumen pufra
ultrafiltracija:
na dnu membrana ki prepušča samo majhn molekule
delujemo s silo
- vaja homogenizacija in obarjanje
izhodni material goveja vranica
-homogenizacija
-nakisanje do pH 3,5
da prekineš interakcije med inhibitorjem in encimom, ki ga želiš izolirati
želimo izolirati proteaze iz lizosoma (kisel pH)
v nevtralnem se veže z inhibitorjem iz citosola, želimo razbiti ta kompleks
-centrifugiranje
-uporabi supernatant
-dodaj (NH4)2SO4 (nekaj proteinov se obori)
-centrifugiraj
-oborjene proteine raztopi v NaCl in shrani za razsoljevanje z gelsko filtracijo
-supernatantu dodaj še (NH4)2SO4
še nekaj proteinov se obiri
-centrifugiraj
oborjene proteine raztopi v NaOAc pufru
kako zmanjšamo neželeno delovanje peptidaz
-nižja temp.
-uporaba inhibitorjev
-nadomestni substrat, ki ga peptidaze lahko cepijo (PSA)
