afinitetna kromatografija Flashcards
na čemu temelji afinitetna kromatografija
afinitetna kromatografija temelji na specifčnih interakcijah
-biološke interakcije→ bioafiniteta
-nebiološke interakcije→ psevdoafiniteta
biološke interakcije
stacionarna in mobilna faza
Kd
stacionarna faza je ena od molekul, imobilizirana (vezana) na nosilec
enim - substrat, inhibitor, kofaktor
receptor - vitamin, hormon
protitelo - antigen
nukleinska kislina - komplementarna nukleinska kislina, protein ki se veže nanjo
protein - drug protein ki se veže nanj
molekula A + molekula B ⇌ kompleks
vzorec + ligand ⇌ kompleks
Kd= [A][B]/[AB]
majhna Kd→ močna vezava
splošno pravilo Kd naj bo < 10-4 M
imobilizacija liganda na nosilec
primerna orientacija (navadno zelo veliko ligandov, zato se s tem ne ukvarjamo)
zadostna dostopnost (brez steričnih ovir)→ vmesnih “spacer”
priprava kolone in nanos vzorca
-kolono ekvilibriramo v začetnem pufru
pufer mora:
omogočati visoko jakost specifičnih interakcij
oslabiti nespecifične interakcije
(navadno nizka ionska jakost)
-volumen vzorca ni bistven
afinitetno kromatografijo lahko uporabimo za konentriranje
nanos velikega volumna vzorca → elucija v majhnem volumnu
najpogosteje uporablja kot 1. stopnja pri izolaciji nekega proteina iz kompleksne zmesi
elucija pri afinitetni kromatografiji
2 načina
ELUCIJA S SPREMEMBO POGOJEV
spremenimo pogoje, tako da oslabimo interakcijo med imobilizirano molekulo in proteinom
-elektrostatske interakcije
zvišamo ionsko jakost
sprememba pH(se izogibamo)
-hidrofobne
znižamo ionsko jakost
dodatek topil z nizko dielektričnno konstanto (se izogibamo)
(-šibki denaturanti ali rahla sprememba temp.)
ELUCIJA S PROSTIM LIGANDOM (najpogosteje)
kolono spiramo s pufrom , ki vsebuje visoko koncentracijo snovi, ki je enaka ali zelo podobna imobiliziranemu ligandu →izpodrinemo imobiliziran ligand
(na protein se veže prost ligand→ dobimo nov kompleks)
primer: izolacija IgG
izolacija IgG s pomočjo proteina A
imunoglobin G ima:
-2 variabilni regiji (kamor se veže antigen)
-konstantna regija (vezava drugih molekul imunskega sistema)
visoka afiniteta med proteinom A in konstantno regijo
protein A imobiliziran
vezava IgG (fiziološki pH)
speremo nevezane proteine
elucija s spremembo pH (oslabimo intrakcije med proteinom A in IgG)
primer: IMAC
IMAC= Immobilized Metal Affinity Chromatography
(imobiliziramo Ni’2+ ione→ nikljeva afinitetna kromatografija)
psevdoafinitetna kromatografija
proteinu z genetskim inženiringom dodamo hestahistidinski rep/ oznako (His6 / “His-tag”) = 6x His = 6x CAT
oznaka je lahko na N- ali C- koncu proteina
stacionarna faza (Ni-NTA-Sepharose)
protein se veže na kolono→ koordinacijski kompleks med His6 in Ni’2+
→ elucija z imidazolom
Zeleni fluorescenčni protein
beta sodček iz 11 trakov
veriga gre tudi skozi sredino sodčka
flourescenca:
absorbira svetlobo nižje λ in emitira svetlobo višje λ
eksitacija vrh: 490nm
emisija vrh: 508nm
4.a vaja: afinitetna kromatografija
odvisnost fluorescence od pH
vpliv denaturacijskih dejavnikov na fluorescenco
-kolono ekvilibriraj z začetnim pufrom WA (Tris, pH 7,4, 500mMNaCl) ali WB (Tris, pH 7,4, 100mM NaCl)
pazi: če prenizka vrenost pH se histidin lahko protonira (imel bo + naboj in se odbijal od ni’2+ ionov)
-nanesi vzorec (lizat bakterijskih celic z GFP)
-postopoma dodajaj začetni pufer
-zbiraj frakcije
-izmeri A280, v zadnji frakciji mora biti 0
-nanesi elucijski pufer E (Tris, pH 7,4, 100mM NaCl, IMIDAZOL)
-frakcijam izmeri A280
-preveri barvo (zelena)
-vezano vrakcijo z najvišjo A280 shrani za nadaljne poskuse (ta ima največ GFP)
odvisnost fluorescence od pH:
zelo stabilen pH, denaturira se v ekstremnih vrednosttih
vpliv denaturacijskih dejavnikov:
dodamo detergent NaDS: da se ne obarjajo in kljub denaturaciji ostanejo topni
detergent že sam po sebi malo denaturira proteine
do približno 40C fluorescenca narašča, nato pada
kakšna je vloga NaCl v pufru za spiranje kolone
hočemo interakcije med mobilno in stacionarno fazo, NE nosilcem
NaCl prepreči nespecifišne elektrostatske interakcije
