elektroforeza in western prenos Flashcards
kaj je elektroforeza
formula za hitrost
elektroforeza= separacijska tehnika, ki temelji na otovanju nabitih delcev v električnem polju
proteine v zmesi ločimo po velikosti
→ preverimo čistost proteina
v= Exq/f
E- električna poljska jakost
q- nabolj delca
f- zavorni koeficient (oblika, poroznost medija)
razlike v elektroforezni gibljivosti delcev
elektroforezna gibljivost µ= v/E = q/f
ločitev delcu temelji na:
-velikosti
-obliki
-naboju
medij za ločevanje: gel
dva tipa elektroforeze
Tipi elektroforez glede na medij za ločevanje:
-papirna (za ločevanje majhnih molekul)
-tenkoplastna (za ločevannje majhnih molekul)
-gelska (za ločevanje velikih molekul)
AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA= AGE
tipično v horizontalni izvedbi
agarozni gel
→ za ločevanje NUKLEINSKIH KISLIN
npr. DNA zelo velike molekule (gel ni tako zamrežen)
POLIAKRILAMIDNA GELSKA ELEKTROFOREZA= PAGE
tipično v vertikalni izvedbi
poliakrilamidni gel (rakotvoren)
polimerizacija akril amid (ni zamrežen) dodamo bis-akrilamid
→ za ločevanje PROTEINOV (gel bolj zamrežen)
smer potovanja: katoda(-) → anoda(+)
Page v treh variantah:
- PAGE pod nativnimi pogoji→ nativna PAGE
ločitev po naboju, velikosti, proteinov ne denaturiramo - PAGE pod denaturirajočimi pogoji→ SDS-PAGE
ločitev po velikosti, v prisotnosti SDS, proteine denaturiramo (detergent natrijev dodecil sulfat) - izoelektrični fokusing→ IF
ločitev po naboju
nativna PAGE
nativna PAGE
izkoriščamo razlike v naboju in velikosti
ohrani se: struktura, kvartarna zgradba, funkcija (*ob izbiri primernih pogojev)
pH elektrolita navadno 8-9 → večina proteinov neg. nabitih → potovanje proti anodi (+)
nanašalni pufer
pred vnosem vzorcem dodamo nanašalni pufer, ki vsebuje
-bromfenol modro (da vidimo vzorec in potovanje)
premika se hitreje kot proteini, zato vemo koliko časa pustiti elektroforezo
-glicerol (ali saharozo) da ima večjo gostoto kot pufer in potone
diskontinuirani geli
dva gela en nad drugim
uporabimo različen pufer pri nalivanju gela
na vrhu: KONCENTRACIJSKI gel (stacking gel, pH 6,8)
manj zamrežen
glicinski ioni tiščijo proteine dol, v koncentracijskem delu izgubijo naboj in se ne premikajo več
vsi proteini v vzorcu se stlačijo v eno črto in hkrati vstopij
spodaj: LOČITVENI del (separating gel, pH 8,8)
bolj zamrežen
dosežemo, da se proteini skoncentrirajo v ozkem pasu → boljša ločljivost
SDS-PAGE
SDS= detergent sodium dodecylsulfate (oz. NaDS, natrijev dodecilsulfat)
PAGE v prisotnosti NaDS
-vzorce obdelamo z SDS (skuhamo za popolno denaturacijo)
-SDS denaturira proteine (polipeptidna veriga se razvije)
-v povprečju se veže na 2 ak-ostanka 1 molekula SDS
npr. protein iz 200 ak ostankov, ki ima navadno majhen naboj (naboj samih ak je zato zanemarljiv)
200 ak ostankov → 100 SDS → naboj približno -100
naboj povezan z dolžino verige
linearna zveza z nabojem in dolžino verige (velikost denaturiranega proteina)
vsi proteini so sedaj negativno nabiti
da zagotovimo res popolno denaturacijo dodamo še DTT ali BME →porušitev disulfidnih vezi → vse proteinske molekule so sedaj popolnoma razvite
določevanje Mr z SDS-PAGE
v en žepek proteine z znano Mr
v drugi naš vzorec (čist protein)
izmrimo razdaljo za standarde in za naš protein
večjo razdaljo ket prepotuje→ manjšo molekulsko maso ima
graf:
x os: logMr
y os: relativna razdalja R1/l
vloga reducenta
nekovalentne interakcije so v vsakem primeru prekinjene
z reducentom prekinemo še disulfidne mostičke
če je iz vsaj iz dveh polipeptidnih verig vidimo razliko
če ima S-S vez noter ni razlike
izoelektrično fokusiranje
proteinov ne denaturiramo → ohrani se kvartarna zgradba, funkcija
ločitev izključitveno po naboju
ponavadi horizontalna izvedba
posebni PA gel: nizka zamreženost + amfoliti
(ko damo gel v el. polje se naredi gradient teh skupin, posledično dobimo gradient pH)
predkofokusiranje → ustvarimo pH gradient soli po gelu
proteinske molekule se ustavijo tam v gelu, kjer je njihov celokupni naboj enak 0, t.j pH = pI
(-) visok pH
(+) nizek pH
če na gel nanesemo zmas proteinov z znanimi pI → lahko določimmo pI neznanega proteina
detekcija proteinov po elektroforezi
proteini niso obarvani
2 osnovna načina detekcije:
NESPECIFIČNA DETEKCIJA
- barvanje z barvili: Coomassie Brilliant blue (CBB, vezava na Lys, Arg in His), meja detekcije 0,1-1µg
-barvanje z AgNO3, meja detekcije 2ng
-avtoradiografija (radioaktivna označenost)
SPECIFIČNA DETEKCIJA
-cimografija (za encime) nativni pogoji, dobimo cimogram
-imunodetekcija: specifična protitelesa (proteine najprej nanesemo na membrano, saj so protitelesa prevelika in ne morejo do proteinov v gelu)
prenos na membrano (blotting) po elektroforezi
-Southern blot → DNA
-Western blot → proteini
-Northern blot → RNA
prenos western
pufer: vsebuje metanol, ki pobere SDS iz proteina
proteini se fiksirajo na membrano preko hidrofobnih interakcij
med gel po elektroforezi (z ločenimi proteini) in anodo (+) damo membrano (nitroceluloza, PVDF)
→ proteini potujejo proti membrani in se nanjo vežejo preko hidrofobnih interakcij
priprava ločevalnega in koncentracijskega gela
elektroforezni pufer
ločevalni gel:
-akrilamid
-Tris/HCl, pH 8,8
-dH2O
-NaDS
-amonijev persulfat
-reagent TEMED
na vrh dHO ali butanol, da se izravna
koncentracijski gel:
-akrilamid
-Tris/HCl, pH 6,8
-dHO
-NaDS
-amonijev persulfat
-reagent TEMED
+ glavniček
elektroforezni pufer:
NaDS, Tris/HCl, glicin
po končani elektroforezi
gel v razt Coomassie Brilliant Blue
razbarva v EtOH in AcOH
