biološko tveganje, homogenizacija Flashcards
laboratoriji glede na stopnjo nevarnosti okužbe
-stopnja 1: dobro znani agensi, ki pri zdravih ljudeh ne povzročajo bolezni (nepatogeni sevi E. coli)
-stopnja 2: vzorci, ki vsebujejo patogene organizme, a za le-te ni znano, da bi povzročali huda obolenja (Salmonella)
-stopnja 3: vzorci, ki vsebujeo znane patogene organizme, ki pri človeku povzročajo huda, tudi smrtna obolenja
-stopnja 4: neznani organizmi, pri katerih posledice okužb niso znane ali pa ni na voljo zdravil/cepiv; nadtlak v oblekah, podtlak v labu (ebla, virus črnih koz)
biološko varovani kabineti
varno delo z biološkimi materiali
3 skupine (I, II in III)
ključen element: filtri (zadržijo 99,9% delcev velikosti 3µm → sterilizacija zraka)
HEPA High Efficiency Particulate Arrestance
I ščitijo delavca, ne materiala
II ščitijo delavca in material
III ščitijo delavca in material
digestorij
digestorij NI biološko varovani kabinet
nima filtra HEPA → nefiltriran zrak gre direktno v okolico
ravnanje z biološkimi odpadki
steklovina, kovinski pribor, plastika → AVTOKLAVIRANJE
tekočine
→ AVTOKLAVIRANJE (20 min, 121C)
→ DODATEK USTREZNE KEMIKALIJE (razkužilo)
razkužilo Ecocid S (perokso spojina, detergent, organske kisline, anorganski pufer → oksidacija)
gojišče LB
bogato s hranili
tekoče, če dodamo agar je trdno
vsebuje:
tripton (vir aminokislin)
kvasni ekstrat (vitamini)
natrijev klorid
homogenizacija
prva stopnja pri vseh izolacijah biološkega materiala
razbitje celičnih sten in membran→sprostitev znotrajcelične tekočine
pomembni dejavniki pri homogenizaciji
-TEMPERATURA
večja stabilnost makromolekul pri nižji T
pogosto denaturacija pri višji T
manjša aktivnost encimov pri nižji T
delamo pri +4C
-pH
izogibamo se skrajnim vrednostnim (denaturacija)
pogosto okoli 7
-REDOKS POTENCIAL
občutljivost na oksidacijo (kisik v zraku)
včasih homogenizacija v prisotnosti reducenta (cistein, DTT)
-OSMOZNI TLAK
pomembno pri izolaciji organelov (pazimo da ne počijo)
izotoničnost: uravnavamo z NaCl, saharozo..
-NEŽELENO DELOVANJE ENCIMOV
sproščanje nukleaz in proteaz
nukleaze→ (če izoliramo DNA) inhibiramo z EDTA (veže Mg in Ca ione, se vežejo na dnaze, te niso več aktivne), citratom (kompleks Mg’2)
peptidaze→ pH, dodatek inhibitorjev ali adomestnega substrata (BSA)
delamo pri nižji temp.
-DETERGENTI
lipidi in membranski proteini netopni v vodi
lipidi→ organska topila (aceton, kloroform)
membranski proteini→ detergenti (SDS, NaDS)
-ADITIVI
pri rastlinah alkaloidi in polifenoli→lahko denaturijajo proteine→ dodamo PVP (da se znebimo polifenolov)
na katere vrste metod delimo homogenizacijo
fizikalne, kemične in encimske metode homogenizacije
fizikalne metode homogenizacije
-terilnica: zamrznjeni organi, rastlinska tkiva
-stresanje s steklenimi kroglicami: za zelo odporna tkiva, celice (rastlinske celice, kvasovke); najpogosteje za glive, tudi bakterije
NE za izolacijo organelov (mitohondriji se uničijo)
-ultrazvok: pogosto pri izolaciji bakterij, razbijanje DNA
-zamrzovanje in odtaljevanje: nastanek kristalov ledu ki poškodujejo celice, lahko škoduje makromolekulam
-osmozni šok: uporaba hipotoničnih raztopin→ celice raznese, nežna metoda a samo za celice brez stene
-teflonski homogenizer: strižne sile, za mehkejša tkiva, ali mešala z nožički (bolj grobo)
kemične metode homogenizacije
-detergenti
raztapljanje lipidne plasti- membrane
SDS, natrijev dodecil sulfat, Na-deoksiholat
-encimi
navadno dodamo takega, da cepi celične stene
lizocim→ razgradnja bakterijskih c. sten
celulaze, pektinaze→ rastlenske c. stene
hitinaze→ glivne c. stene
centrifugiranje
posedanje delcev zaradi delovanja centrifugalne sile
vpliv:
večji delci hitreje
večja razlika v gostoti hitreje
manjša viskoznost hitreje
večja kotna hitrost hitreje
suspenzija→
-flotant: na vrhu, lipidi iz c. membran (zelo malo)
-supernatant: vse kar je topno
-sediment/pelet: večji delci (razbite celice, včasih tudi jedra)
katera stopnja izolacije je centrifugiranje
primerljivost med različnimi centrifugami
centrifugiranje 2. stopnja izolacije, takoj po homogeniziranju
za primerljivost med centrifugami/rotorji uporabimo g RCF
RCF = relative centrifugal force
opiši 1. vajo homogenizacija
-nastrižemo jetra v čašo
-dodatek saharoze (rahlo hipotonična)
-teflonski homogenizer, 5-10 pasaž
-filtracija skozi gazo
-v centrifugirko saharozo (vzdržujemo izotoničnost) + homogenat
-centriffugiranje
-supernatant + NaDS se zbistri
noter organeli, citoplazmski proteini, topne molekule, cistoplazma
-pelet + NaDS postane sluzasto
noter jedra, nerazbite celice
sprosti se kromatin, dokaj sluzast
