Méthodes d'études des macromolécules Flashcards
Sur quel type de matériel analyse-t-on ?
Le gène (ADN), l’ARNm ou encore la protéine (surtout en biochimie)
Que pouvons nous analyser sur une protéine ?
- une analyse qualitative : présence ou non voire localisation
- une analyse quantitative
- une analyse fonctionnelle : interaction entre protéines
Quels sont les différents biomarqueurs que peuvent posséder les protéines ?
- l’interactome
- le lipidome
- le glycome
- métabolome
- protéome
Quels sont les grands principes pour étudier les protéines ?
- méthodes d’études physiques
- méthodes d’études immunologiques
- méthodes in silico
En quoi consiste les méthodes d’études physiques ?
La séparation et identification fondées sur les propriété physico-chimiques des AA, peptides, protéines
En quoi consiste les méthodes d’études immunologiques ?
Identification fondée sur la reconnaissance Antigène-Anticorps
En quoi consiste les méthodes in silico ?
C’est la caractérisation fondée sur des comparaisons et des probabilités (étude de fonction selon la séquence peptidique)
Qu’est-ce que la centrifugation ?
C’est une technique séparatrice à vitesse de rotation variable avec sédiment ou culot solide et surnageant, phase liquide, c’est plus un préalable des méthodes d’études
Qu’est-ce qu’une centrifugation en gradient de densité ?
Une technique de séparation des particules selon leur encombrement et leur solubilité
Qu’est-ce qui peut influencer la précipitation ?
Le pH et la salinité
Comment le pH influence-t-il la précipitation d’une protéine ?
Une protéine atteint son minimum de solubilité lorsque le pH du milieu est égal à son pHi induisant donc sa précipitation
Quel est l’inconvénient de l’utilisation du pH pour la précipitation ?
Le pH peut dénaturer les protéines, ça n’est donc pas adapté à toutes les études
Comment la salinité influence-t-elle la précipitation ?
Lorsqu’on salinise une solution, on fait diminuer la solubilité des protéines et induit leur précipitation
Qu’est-ce que la dialyse ?
C’est une technique de séparation où l’on va poser le sac à dialyse dans un bécher, on va donc concentrer le sac de grosses molécules puisque les petites molécules vont équilibrer leur concentration entre le sac à dialyse et le bécher, pouvant traverser la membrane du sac
Qu’est-ce que la chromatographie ?
C’est une technique d’analyse pouvant aussi être utilisée en préparation par d’autres, pouvant plus précisément séparer les constituants d’un mélange fondé sur les phénomènes d’adsorption et de partage
En quoi consiste la chromatographie ?
Elle consiste en l’entraînement d’une phase mobile, liquide à travers une phase fixe, solide, les différentes particules de l’échantillon seront éluées par le solvant ou non selon leur affinité avec la phase fixe
Selon précisément quelles propriétés les propriétés migreront ?
Selon leur hydrophilie, leur pHi ou leur Masse moléculaire, ils migreront plus ou moins vite
Qu’est-ce que la CLHP ?
La chromatographie liquide haute performance est une technique de chromatographie où l’on améliore les performances de séparation en mettant la phase mobile sous pression
Comment identifier les différents constituants dans un chromatogramme ?
On va comparer avec les temps d’élution de molécules témoins, cherchant donc des pics semblables
De quoi est composé la phase fixe contenue dans la colonne de la chromatographie ?
de résine poreuse
Quels sont les principes de la chimie des protéines dans la chromatographie ?
Plus une protéine présente des groupements polaires, plus elle est soluble dans l’eau, plus elle présente des groupements apolaires plus elle est soluble dans les solvants organiques et les protéines sortent dans l’ordre inverse de leur affinité pour la résine
Quels sont les deux grands types de chromatographie ?
Les chromatographies en phase liquide (phase mobile liquide) et les chromatographies en phase gazeuse (phase mobile gazeuse)
Quels sont les différents types de chromatographie en phase liquide ?
- chromatographie liquide-liquide
- chromatographie d’exclusion stérique
- chromatographie d’adsorption en phase inverse ou non
- chromatographie d’affinité
- chromatographie d’échanges d’ion
En quoi consiste la chromatographie d’exclusion stérique ?
Elle est fondée sur la taille avec une phase solide relativement poreuse où les grosses protéines sont éluées en première, puisque les petites molécules vont se coincer dans la phase fixe
En quoi consiste la chromatographie d’affinité ?
C’est une chromatographie où la phase fixe va présenter un produit avec une affinité pouvant être un ligand ou encore un anticorps, on va ensuite modifier leur affinité pour faire éluer notre protéine d’intérêt
En quoi consiste les chromatographies d’échanges d’ions ?
Echange de cations -> support chargé négativement
Echange d’anions -> support chargé positivement
Puis on va ajouter des ions avec forte affinité pour essayer d’éluer les protéines d’intérêt
Quel est la propriété importante à connaitre avant une chromatographie d’échanges d’ions ?
Le pHi
En quoi consiste le principe d’interactions hydrophobes en chromatographie ?
Les protéines, les résidus hydrophobes vont avoir une affinité variable avec le gel porteur de groupements hydrophobes et élués par des solvants peu salins ou un solvant type éthylène glycol
Quels sont les autres types de protéines pouvant être identifiés dans une chromatographie ayant pour principe d’interactions hydrophobes, et expliquez son fonctionnement
Ce sont les protéines dénaturées, faisant des interactions hydrophobes avec groupes apolaires de la matrice et éluées par solvant organique type acétonitrile
Dans quel cas pouvons-nous utiliser la spectrophotométrie ?
Lorsque notre protéine présente des acides aminés à chaine cyclique notamment la phénylalanine, tryptophane et tyrosine
Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?
C’est une technique de séparation de molécules ionisées en fonction de leur masse rapportée à leur charge
Dans quel milieu faisons-nous une spectrométrie de masse ?
En milieu acide
Quels sont les étapes de la spectrométrie de masse ?
1) Volatiliser : séparer les molécules les unes des autres : matière condensée -> état gazeux
2) Ioniser : transformer les molécules en ions (champ électrique) puis passage dans un champ électrique pour les séparer en fonction de m et de z
3) Mesurer les rapports m/z : La Masse moléculaire est mesurée à partir du rapport m/z
Par quelle autre technique la spectrométrie de masse peut-elle être couplée ?
Elle peut être couplée par une chromatographie liquide ou gazeuse permettant d’assurer la spécificité de la SM (spectrométrie de masse)
Quelles sont les applications de la SM ?
Une approche qualitative ou semi quantitative, ou encore une approche quantitative, après comparaison à des étalons et établissement d’une courbe de calibration
Quel est le rôle d’un étalon interne ?
C’est une substance quasi identique à la molécule d’intérêt, ajoutée dans l’échantillon dans le but de corriger les pertes et les effets de la matrice pouvant subvenir lors de l’analyse et permettant de vérifier la présence de la molécule d’intérêt
Qu’est-ce qu’une droite de calibration ?
C’est une droite reliant l’intensité du signal avec la concentration, cela permet d’obtenir une approche quantitative bien précise
Quels étalons peuvent être utilisés ?
Les étalons sont quasi identiques des molécules d’intérêt sauf pour certains atomes qui vont être synthétisés sous un isotope différent
Qu’est-ce que la MALDI ?
C’est une autre technique de spectroscopie de masse avec un dosage moins performant, utilisé pour faire des profils d’un mélange de manière rapide
En quoi consiste la MALDI ?
Un système va être adsorbé sur un support solide et on va mettre un laser dessus induisant la désorption et la désolvatation
Quelle est autre application de la spectrométrie de masse ?
C’est la protéomique
Quelle est l’approche historique de la protéomique ?
On séparait les protéines par électrophorèse, on va prendre un spot, le casser puis faire une spectrométrie de masse pour l’identifier
Quel est l’autre intérêt de la spectrométrie de masse ?
Séquençage plus de peptides que de protéines
En quoi consiste le séquençage par spectrométrie de masse ?
On va tout d’abord couper la protéine en peptides puis faire un séquençage de chacun des peptides par la méthode récurrente d’Edman
En quoi consiste la méthode récurrente d’Edman ?
On va utiliser de l’isothiocyanate de phényl (ITCP) qui va s’associer à l’AA N-ter du peptide, le dérivé cyclique va se détacher et identifié par chromatographie échangeuses d’ions et spectrométrie de masse, puis répétition
Quels sont les clivage de peptides possible ?
Par hydrolyse chimique et hydrolyse enzymatique
Quel composé chimique est utilisé pour l’hydrolyse chimique et que clive-t-il ?
Le bromure de cyanogène clivant les méthionines du côté C-ter
Quels composés chimiques sont utilisés pour l’hydrolyse enzymatique et que clivent-ils ?
- la trypsine (Lys, Arg sauf si Pro à droite)
- la pepsine (Phe, Try, Tyr, Leu sauf si Pro à gauche)
- la chymotrypsine (Phe, Try, Tyr, Leu sauf si Pro à droite)
Sur quel côté les clivages enzymatiques sont-ils effectués ?
En C-ter
Comment augmenter la précision de la spectrométrie de masse avec des concentrations faibles ?
En utilisant un double spectrométrie de masse
Que permet le double spectrométrie de masse ?
Il permet le séquençage d’un peptide
Qu’est-ce que la diffraction aux rayons X ou cristallographie ?
On va pointer un rayon X sur un cristal de protéines et étudier la tâche de diffraction, c’est une approche qualitative
Qu’est-ce que la Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) ?
C’est une technique consistant à soumettre une protéine à un champ magnétique qui va se mettre à vibrer qu’on va pouvoir mesurer et dont l’intensité va dépendre des composés chimiques
Qu’est-ce que l’électrophorèse ?
C’est une technique de séparation en fonction de leur charge et de leur masse sous l’impulsion d’un champ électrique
Comment simplifier les résultats d’une électrophorèse ?
En supprimant le facteur de charge et ne faisant migrer les protéines que selon leur masse (on a transformé leur charge pour qu’ils migrent tous à travers le gel)
Pourquoi travailler avec une électrophorèse en conditions dénaturantes ?
Parce que souvent les protéines en fonction de leur conformation spatiale peuvent avoir du mal à migrer dans le gel
Comment dénaturer les protéines ?
Par chaleur et par des agents réduisant les ponts disulfures et assurant une charge uniforme (SDS) -> SDS-PAGE
Pourquoi utiliser des marqueurs de masse moléculaires et témoins dans les électrophorèses ?
Pour s’assurer de la présence de la protéine d’intérêt et pour avoir une certaine échelle de masse moléculaires
Quelle est l’utilité des marqueurs de charge ?
Ce sont des protéines de quantité constante connue dans le prélèvement qui témoigne la qualité du dépôt
Qu’est-ce que l’immunoprécipitation ?
L’utilisation d’anticorps contre notre protéine d’intérêt puis on va ajouter des billes avec forte affinité avec les anticorps, après centrifugation, il ne restera que les anticorps et les protéines (précipité)
Quelle est l’utilité de l’immunoprécipitation ?
Elle permet de mettre en évidence et d’étudier les interactions
Elle peut aussi purifier un mélange ou encore l’enrichir
Qu’est-ce que l’électrophorèse bidimensionnelle ?
Les protéines vont d’abord être séparées selon leur pHi puis ils vont migrer dans le gel selon leur masse moléculaire
Qu’est-ce que l’iso-électrofocalisation ?
C’est un gel cylindrique présentant un gradient de pH avec le pH le plus élevé au sommet du cylindre, les protéines se focalisent à leur point isoélectrique
Qu’est-ce que l’ELISA ?
C’est une technique employant les anticorps couplés à un signal
Quels sont l’avantage de l’ELISA ?
On peut utiliser plusieurs anticorps se liant sur un épitope pour augmenter le signal
Quelle est l’utilité de la cytométrie de flux ?
Elle permet de compter des cellules fluorescentes, quantifier l’intensité de fluorescence corrélée au niveau d’expression de la protéine, la taille et granulométrie des cellules
Qu’est-ce que la LUMINEX ?
C’est une technologie de petites billes couplées avec pleins d’anticorps à leur surface, pouvant quantifier plein de protéines d’un coup
Quel est le problème de la LUMINEX ?
C’est une quantification pas si précise que cela
Qu’est-ce que la protéomique ?
C’est le principe d’étude de toutes les protéines d’un tissu, pour étudier les protéines à l’origine de pathologies
Quelle est l’approche technique des méthodes d’études ?
En quoi consiste les méthodes d’étude in silico ?
Analyse de structure, comparaison de protéines, prédire la structure tridimensionnelle et prédire l’impact d’une mutation, l’impact d’une mutation sur une protéine interspécifique
Quelles sont les méthodes d’études des protéines utilisées pour le diagnostic ?
- le dosage des protéines totales
- l’électrophorèse des protéines plasmatiques
- le dosage de protéines spécifiques
- l’analyse par protéomique
Comment faire du dosage de protéines totales ?
- spectrophotométrie
- immunonéphélémétrie : quantifie la lumière diffusée à travers en solution
- immunoturbidimétrie : quantifie la lumière transmise (réfractée ou passant à travers, en gros l’absorbance)
Quel est l’intérêt de l’électrophorèse des protéines plasmatiques ?
L’identification d’immunoglobuline monoclonale mettant à l’évidence la présence de cancer par exemple
Quelles sont les deux grandes méthodes d’étude des protéines ?
C’est les méthodes d’étude physico chimiques et immunologiques qui peuvent même être associées
