Méthodes d'étude des variations du génome 2 Flashcards
Qu’est-ce que la définition du clonage ?
Insérer un ou des fragment(s) d’intérêt dans l’ADN génomique purifié d’un élément génétique autoréplicatif (virus ou plasmide)
Quel est le but du clonage ?
Obtenir un grand nombre de copies absolument pures d’une séquence donnée d’ADN
Quel est le matériel nécessaire pour le clonage ?
- Des fragments d’ADN à insérer dans le vecteur directement : ADN génomique, séquence d’intérêt dans l’ADN génomique, produit PCR, ADNc (ADN complémentaire) après transcription inverse des ARNm
- Obtention à partir d’une digestion enzymatique :
enzymes de restriction sauf pour insertion “ADNc entier”
Quelles sont les propriétés du vecteur ?
- réplication active dans la cellule hôte indépendamment de l’ADN de la cellule hôte
- taille compatible avec insertion de grands fragments et manipulation aisée des recombinants
- sélection des cellules qui l’ont incorporé : marqueur de sélection
- stable dans l’hôte
- sites uniques de coupure par les enzymes de restriction
- sites multiples de clonage : “polylinker”
- multiplication sans effet sur l’hôte
- purification simple
De quoi dépend le type de vecteur ?
De la taille de l’ADN cloné
Qu’est-ce que les plasmides ?
C’est un ADN circulaire extrachromosomique (< 3kb), réplication indépendante dans les bactéries et insert de 0,2 à 4 kb (10 max), utilisé comme vecteur
Pourquoi le plasmide peut-il se répliquer de manière autonome ?
Parce qu’il possède sa propre origine de réplication
Quelles autres séquences contient un plasmide ?
Deux gènes qui vont permettre la sélection des cellules qui auront incorporé le vecteur recombinant et au sein du gène LacZ il y a le polylinker
De quoi dépend le choix de l’hôte ?
Il dépend principalement du vecteur utilisé
Quelles sont les grandes catégories d’hôte ?
- les hôtes bactériens
- les hôtes eucaryotes
Donner un exemple d’hôte bactérien
La E Coli, la plus utilisée (bactéries non pathogènes)
Quels sont les avantages des hôtes bactériens ?
Multiplication rapide, faciles à manier, peu coûteux
Donner des exemples d’hôtes eucaryotes
Cellules de Mammifères, levures, plantes…
Quel est l’intérêt d’utiliser un hôte eucaryote ?
Pour la production de protéines devant subir des modifications post-traductionnelles non réalisées par les bactéries, possibilité d’utiliser des “vecteurs navettes” : passage entre système procaryote et eucaryote
Quelles sont les principales étapes de réalisation d’un clonage ?
1) Préparation du fragment d’ADN à cloner
2) Préparation du fragment d’ADN et du vecteur
3) Réalisation de l’ADN recombinant : insert + vecteur
4) Transformation des bactéries
5) Sélection des bactéries
6) Criblage de la banque : identification des clones positifs
Comment est obtenu les fragments d’ADN à cloner ?
- Par digestion enzymatique à partir de fragment d’ADN génomique pour l’obtention du fragment d’ADN => extrémités cohésives; digestion totale ou ménagée
- Obtention de l’ADNc par transcription inverse à partir d’ARN
Pourquoi faut-il ajouter de courtes séquences au brin complémentaire ?
Pour que le brin complémentaire soit intact après digestion enzymatique
Comment se fait la préparation du vecteur ?
- coupure de fragments d’ADN et du vecteur par la même enzyme
- traitement du plasmide par la phosphatase alcaline : étape de déphosphorylation des extrémités
Pourquoi couper par la même enzyme ?
Pour avoir des extrémités cohésives compatibles
Pourquoi déphosphoryler ?
Parce que la séquence aura tendance à se refermer sur elle même
Comment se fait la réalisation de l’ADN recombinant : insert + vecteur ?
Grâce une ligase usant de l’ATP qui va faire des liaisons diester sur certaines extrémités
Que se passe-t-il sur les extrémités sur les extrémités sans liaison ?
Il y a raboutage final dans la bactérie
Qu’est-ce que la transformation des bactéries ?
C’est l’obtention des bactéries recombinantes
En quoi consiste la transformation des bactéries ?
L’ADN recombinant est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique (électroporation) ou par lipofection (complexe lipidique cationique = liposomes)
Comment se fait la sélection des bactéries ?
Tout d’abord par ATB qui va éliminer les bactéries vides et laissant les bactéries + plasmide et les bactéries + plasmide recombinant
Comment différencier les plasmides vides et recombinants ?
En rajoutant le substrat (X gal), on pourra vérifier quelles colonies possèdent des β galactosidases actives ou non selon qu’elles soient bleues (X gal clivé) ou blanches
Quel est le rendement ?
C’est un rendement faible : 10^6 - 10^9 clones /µg d’ADN
Que permettent les vecteurs d’expression ?
Ils permettent de cloner des fragments d’ADN complémentaires qu’on place en aval, sous le contrôle d’un promoteur fort
Pourquoi le nom des enzymes sont différentes ?
Parce qu’il faut orienter plutôt forcer l’orientation de l’ADNc dans le vecteur
Que permettent des transfections stables des cellules eucaryotes ?
C’est un processus plus long et complexe que celui transitoire mais permet d’avoir une expression stable au cours du temps à travers des divisions cellulaires
Donner deux exemple d’applications en biologie/médecine des vecteurs d’expression
- Gène rapporteur (activité transcriptionnelle d’un promoteur)
- Double hybride : interactions protéine-protéine (ou protéine-ADN)
Sur quelle protéine est basée le principe du double hybride ?
Sur la Gal4
Qu’est-ce que la Gal4 ?
C’est un facteur protéique de transcription possédant deux domaines DBD qui se fixe à la séquence au niveau du promoteur et TAD qui active la transcription
Quelle est la relation entre les 2 domaines ?
Seules et sans interaction physique et directe, les domaines ne peuvent pas activer la transcription
Comment utiliser ce principe pour révéler les interactions entre deux protéines ?
On va accrocher A “Appât” au domaine DBD et P “Proie” au domaine TAD, et si il y a interaction : il y a transcription, que ce soit une reconnaissance constitutive ou conditionnelle (avec un ligand)
Que permet ces révélations ?
On peut faire un screening de protéines capables de se lier à A
Comment se fait cette technique ?
Par la construction au préalable d’une banque d’ADNc de protéines de fusion incluant TAD puis identification des clones comprenant un domaine P capable de se lier à A
Quelle est la particularité de cette technique ?
Elle est très sensible et non applicable aux protéines membranaire
Exemple
En quoi peut être déclinée cette technique ?
Elle peut être déclinée en une technique pouvant révéler l’interaction entre 3 ou encore 4 protéines
